余文敏，張曉毅，王智，陳平圣，竇駿

(東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的腎小管上皮細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下RAB7的表達(dá)及位置變化

余文敏，張曉毅，王智，陳平圣，竇駿

(東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

目的：了解缺氧狀態(tài)下RAB7蛋白在穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7表達(dá)載體的腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及位置變化，驗(yàn)證其對細(xì)胞自噬與內(nèi)吞現(xiàn)象的指示作用。方法：構(gòu)建GFP-RAB7表達(dá)融合蛋白慢病毒載體轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，缺氧處理后，采用RT-qPCR、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)檢測外源基因RAB7在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及位置的變化。結(jié)果：成功將GFP-RAB7基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到HK-2細(xì)胞中，并獲得穩(wěn)定表達(dá)GFP-RAB7蛋白的HK-2細(xì)胞；在缺氧狀態(tài)下，RAB7 mRNA的表達(dá)輕微降低，蛋白水平?jīng)]有變化；激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)GFP-RAB7蛋白發(fā)生聚集，顯示自噬與內(nèi)吞的形成。結(jié)論：成功建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的表達(dá)GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞系，GFP-RAB7融合蛋白可指示自噬與內(nèi)吞現(xiàn)象，為研究缺氧狀況下腎小管上皮細(xì)胞自噬與內(nèi)吞提供了有效工具。

缺氧； GFP-RAB7蛋白； 腎小管上皮細(xì)胞； 自噬； 內(nèi)吞

2000年Fine等[1]提出慢性缺氧假說，強(qiáng)調(diào)腎小管間質(zhì)的慢性缺血損傷是各種腎臟病發(fā)展為終末期腎病的共同通路。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞對缺氧十分敏感，易因此而損傷并釋放炎癥介質(zhì)，促進(jìn)疾病的發(fā)展，但具體機(jī)制尚未完全搞清[2-3]。

自噬(autophagy)是一種細(xì)胞代謝方式，細(xì)胞將自身的胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器以形成自噬泡的形式由溶酶體降解，以清除細(xì)胞內(nèi)衰老損傷的細(xì)胞器、聚集的變性蛋白和循環(huán)再利用氨基酸等。內(nèi)吞作用(endocytosis)是細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)陷將細(xì)胞外物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)的過程。研究顯示，缺氧促進(jìn)細(xì)胞自噬和內(nèi)吞[4]，因此若要揭示慢性腎臟病進(jìn)展機(jī)制，小管上皮細(xì)胞自噬和內(nèi)吞是極為重要的研究領(lǐng)域。盡管檢測自噬和內(nèi)吞的方法較多，但既簡便又能動態(tài)觀察的方法甚少。RAB7存在于自噬體和晚期內(nèi)吞體膜上，是自噬體和內(nèi)吞體成熟所必需的共享分子之一[5]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)染慢病毒表達(dá)載體，使腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)和RAB7的融合綠色熒光蛋白；并在體外模擬缺氧狀態(tài)下，觀察GFP和RAB7融合綠色熒光蛋白中的表達(dá)及位置變化，為了解腎小管上皮細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生自噬和內(nèi)吞的程度提供一種簡單、直觀的研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

HK-2細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞資源庫，GFP-RAB7慢病毒過表達(dá)載體委托上海吉瑪生物公司構(gòu)建，G418、RIPA蛋白裂解液、丙烯酰胺、化學(xué)發(fā)光液、BCA蛋白定量試劑盒和熒光定量試劑盒購自諾唯贊生物公司，PVDF膜購自Millipore公司，RAB7抗體購自Abcam公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自Protech公司，引物由上海桑尼生物公司合成。

1.2 HK-2細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HK-2細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度以確保第2天每孔能達(dá)到80%為宜，采用DMEM+10% FBS培養(yǎng)基(無雙抗)，置于培養(yǎng)箱中，體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃、飽和濕度下培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定 按照上海吉瑪生物公司提供的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以終濃度為500 ng·ml-1的G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。熒光顯微鏡下觀察經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白情況，適時熒光定量PCR檢測RAB7 mRNA表達(dá)水平(具體方法見下述)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞分為常氧組和缺氧組。常氧組為正常氧氣濃度(O2體積分?jǐn)?shù)21%)的培養(yǎng)條件，體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h；缺氧組在CO2/N2/O2體積分?jǐn)?shù)為5%/94%/1%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別重復(fù)3次。

1.3 RNA提取與適時熒光定量PCR

參照Invitrogen公司的RNA提取試劑盒說明書；反轉(zhuǎn)錄采用諾唯贊公司提供說明書。適時熒光定量PCR以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用諾唯贊公司的SYBRGreenI嵌合熒光法定量試劑盒，用2-△△t定量法分析數(shù)據(jù)結(jié)果。引物序列為：RAB7基因上游引物5′-CATCCTGGGAGATTCTGGAGTC-3′，下游引物5′-TGTGTCCCATATCTGCATTGTG-3′(產(chǎn)物156 bp)；GAPDH基因：上游引物AAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC(產(chǎn)物150 bp)。

1.4 蛋白提取與蛋白質(zhì)印跡

收集各組細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液溶解細(xì)胞，以14 000×g、4 ℃離心15 min。將蛋白定量后，取40 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠分離，4 ℃恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3% BSA封閉1 h，TBST洗膜5 min，3次。加入RAB7抗體(1∶1 000稀釋)。TBST洗膜5 min，3次，再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(1∶3 000稀釋)孵育1 h，TBS洗膜5 min，3次。ECL顯色。以GAPDH抗體(1∶3 000稀釋)作為對照。

1.5 激光共聚焦顯微鏡(LSCM)掃描

穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的細(xì)胞鋪滿孔底80%左右傾去完全培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍后加入無血清低糖DMEM。細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中低氧培養(yǎng)，條件同上，培養(yǎng)24 h后PBS沖洗3遍，用預(yù)冷的多聚甲醛固定30 min。在LSCM(奧林巴斯FV1000，日本)下觀察并拍攝GFP-RAB7的表達(dá)和位置變化情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包(SPSS Inc，美國)分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異分析用t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞鑒定

熒光顯微鏡下，穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞漿內(nèi)可見高強(qiáng)度翠綠色熒光(圖1)，用DAPI染核顯示，RAB7蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，表明轉(zhuǎn)染效率為100%及RAB7的表達(dá)位置正確。適時熒光定量PCR檢測顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞RAB7 mRNA表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染RAB7蛋白的HK-2細(xì)胞在mRNA表達(dá)水平是未轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞的48.0±2.86倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞GFP-RAB7綠色熒光蛋白表達(dá)情況 A.細(xì)胞核顯示深藍(lán)色熒光(DAPI染色，20×10)； B.胞漿呈現(xiàn)翠綠色熒光(20×10)； C.細(xì)胞核熒光與胞漿熒光重合圖(20×10)

Fig 1 The expression of stably transfected GFP-RAB7 in HK-2 cellsA.Nuclear staining showed blue fluorescence with DAPI(DAPI staining，20×10); B.The Cytoplasm presented green fluorescence(20×10); C.The merge of nucleus fluorescence and green fluorescence in cytoplasm(20×10)

2.2 缺氧狀態(tài)下GFP-RAB7的位置變化

通過LSCM在高倍視野下觀察發(fā)現(xiàn)，常氧組細(xì)胞GFP-RAB7熒光顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，無聚集發(fā)生；缺氧之后細(xì)胞自噬與內(nèi)吞增強(qiáng)，RAB7蛋白在細(xì)胞質(zhì)中熒光顆粒明顯聚集，顯示細(xì)胞自噬與內(nèi)吞的發(fā)生，并有靠近細(xì)胞核周圍的趨勢(圖2)。常氧組細(xì)胞GFP-RAB7熒光顆粒散在分布于細(xì)胞質(zhì)中；缺氧組細(xì)胞質(zhì)中熒光顆粒聚集，主要分布在細(xì)胞核周圍。

圖2 缺氧狀態(tài)下GFP-RAB7熒光顆粒位置變化(LSCM)

Fig 2 The position change of GFP-RAB7 green fluorescent protein in HK-2 cells under hypoxia(LSCM)

2.3 缺氧狀態(tài)下GFP-RAB7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的RAB7 mRNA表達(dá)情況

缺氧狀態(tài)下，穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞的RAB7蛋白盡管位置發(fā)生變化，RAB7的mRNA水平的表達(dá)有所減少，常氧組的表達(dá)量為1.0±0.32，缺氧組為0.8±0.06，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 缺氧狀態(tài)下GFP-RAB7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的RAB7蛋白的表達(dá)情況

蛋白質(zhì)印跡檢測顯示，缺氧和常氧狀態(tài)下GFP-RAB7的HK-2細(xì)胞中RAB7蛋白的表達(dá)沒有變化(圖3)。

圖3 缺氧和常氧狀態(tài)下GFP-RAB7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞RAB7蛋白表達(dá)和比較 A.RAB7蛋白表達(dá)； B.RAB7蛋白表達(dá)比較； 1、2.常氧； 3、4.缺氧

Fig 3 The expression and comparison of RAB7 in HK-2 cell with GFP-RAB7 protein in normoxia and hypoxiaA.The expression of RAB7 protein; B.The comparison of RAB7 protein； 1，2.normoxia； 3，4.hypoxia

3 討 論

在慢性腎臟病，腎小管周圍微血管往往呈進(jìn)行性缺失，引起或加重腎間質(zhì)缺氧，并且缺氧刺激下的血管新生反應(yīng)又明顯不足，最終使纖維化呈進(jìn)行性發(fā)展。研究顯示腎近端小管細(xì)胞可能是缺氧損傷的主要目標(biāo)[6]；損傷的腎小管上皮細(xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)參與纖維化的發(fā)展[7]。因此，研究缺氧情況下腎小管上皮細(xì)胞的代謝及功能變化，對于了解腎臟纖維化形成機(jī)制大有裨益。自噬和內(nèi)吞是細(xì)胞進(jìn)化上極為保守的代謝方式，缺氧狀況下，細(xì)胞自噬、內(nèi)吞活躍，且常相伴發(fā)生，闡釋其變化程度與細(xì)胞功能狀態(tài)的關(guān)系無疑是十分重要的。

透射電子顯微鏡仍然是檢測自噬和內(nèi)吞現(xiàn)象的金標(biāo)準(zhǔn)，但樣品制作繁瑣，設(shè)備昂貴，有時清晰度欠佳，最欠缺之處是不能動態(tài)觀察。有研究顯示，利用GFP-LC3融合蛋白特異性定位自噬泡，通過觀察細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒的量及分布情況，可以實(shí)時監(jiān)測細(xì)胞自噬的進(jìn)程，現(xiàn)已成為研究細(xì)胞自噬的重要方法[6，8-9]。但是GFP-LC3的融合蛋白僅能顯示自噬程度，不能反映內(nèi)吞程度，也就無法全面顯示細(xì)胞的自噬與內(nèi)吞的水平。

Rab7存在于自噬體和晚內(nèi)吞體膜上，是自噬體和內(nèi)吞體成熟所必需的共享分子之一，屬小GTP酶，能導(dǎo)引胞內(nèi)貨物沿微管運(yùn)輸，最后參與自噬體和內(nèi)吞體與溶酶體的融合過程，目前認(rèn)為該分子是調(diào)控自噬和內(nèi)吞的關(guān)鍵分子[5]。

本研究將GFP-RAB7慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人的腎小管上皮細(xì)胞系，通過觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度和RAB7基因表達(dá)，證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。經(jīng)缺氧處理后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-RAB7的細(xì)胞中出現(xiàn)大量綠色熒光顆粒聚集于細(xì)胞核附近，有別于非缺氧細(xì)胞的熒光顆粒分布，結(jié)合其他作者相關(guān)報道[6]，我們認(rèn)為該現(xiàn)象提示GFP-RAB7熒光融合蛋白能反映細(xì)胞自噬與內(nèi)吞活動。但是在缺氧狀態(tài)下，該穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株并未出現(xiàn)RAB7表達(dá)量的明顯變化，說明缺氧可能不影響RAB7的基因活動，只影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布，進(jìn)一步說明慢病毒融合蛋白指示自噬與內(nèi)吞現(xiàn)象的特異性。由于穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株能傳代培養(yǎng)，這就為后續(xù)研究HK-2細(xì)胞自噬與內(nèi)吞提供了有效工具，同時也可以作為反映細(xì)胞缺氧程度的候選分子標(biāo)記。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7表達(dá)載體的腎小管上皮細(xì)胞系，使缺氧狀態(tài)下細(xì)胞自噬和內(nèi)吞程度得以實(shí)時監(jiān)測，為深入研究慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了便利，但仍需進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)、生物學(xué)行為以及功能變化，以便為推廣應(yīng)用打下堅實(shí)基礎(chǔ)。

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Changes of expression and location of RAB7 in HK-2 cells stably transfected GFP-RAB7 protein under hypoxia

YU Wen-min，ZHANG Xiao-yi，WANG Zhi，CHEN Ping-sheng，DOU Jun

(SchoolofMedicine,SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To establish the HK-2 cell line (human proximal tubular cells) stably transfected an expressing vector of human GFP-RAB7 fused protein，and detect its indicative function of autophagy and endocytosis under hypoxia. Methods: Lentiviral expression vector of human GFP-RAB7 fused protein was constructed， and then stably transfected to HK-2 cell line. The expression and location of GFP-RAB7 were detected by RT-qPCR， Western blot and laser scanning confocal microscope(LSCM). Results: The HK-2 cells transfected the vector stably expressed GFP-RAB7 fused protein. These results indicated that the level of RAB7 mRNA was decreased under hypoxic conditions， while hypoxia did not affect the expression of total amount of RAB7 protein. The result of LSCM showed the aggregation of GFP-RAB7 and formation of autophagosome in transfected HK-2 cells under hypoxia. Conclusion: We have successfully constructed a stable transfected HK-2 cell line which expresses GFP-RAB7 protein. The fuse protein could be a good indicator for autophagy and endocytosis. It may provide a simple and effective method for studying autophagy and endocytosis in cells.

hypoxia; GFP-RAB7 protein; proximal tubular cell; autophagy; endocytosis

2015-06-29

2015-07-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370868)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項(xiàng)目(KYLX_0197)

余文敏(1978-)，男，江西九江人，在讀博士研究生。E-mail:yuwenmin2013@126.com

陳平圣 E-mail：chenpsh@sina.com 竇駿 E-mail:njdoujun@seu.edu.cn

余文敏，張曉毅，王智，等.穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-RAB7的腎小管上皮細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下RAB7的表達(dá)及位置變化[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(5)：710-714．

R361.3； R364.4

A

1671-6264(2015)05-05-0710-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.006