石任任，王珊，何穎，鄒澤紅，張可俊，李林梅，肖春梅，關(guān)志澳，陶愛林

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院/呼吸疾病國家重點實驗室變態(tài)反應研究室/變態(tài)反應國家臨床重點?？?廣東省過敏反應與免疫重點實驗室，廣東 廣州 510260)

·論 著·

小鼠骨髓來源肥大細胞的誘導培養(yǎng)及功能鑒定

石任任，王珊，何穎，鄒澤紅，張可俊，李林梅，肖春梅，關(guān)志澳，陶愛林

(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院/呼吸疾病國家重點實驗室變態(tài)反應研究室/變態(tài)反應國家臨床重點專科/廣東省過敏反應與免疫重點實驗室，廣東 廣州 510260)

目的：探討體外誘導培養(yǎng)小鼠骨髓細胞來源肥大細胞的方法，為體外組胺激發(fā)試驗提供試材。方法：采用白細胞介素3(IL-3)和干細胞因子(SCF)聯(lián)合刺激小鼠骨髓細胞4、6周誘導其分化為肥大細胞，光鏡下觀察細胞形態(tài)，甲苯胺藍染色觀察細胞成熟度，蛋白免疫印跡法分析表面FcεRⅠ和CD117表達情況，HistaReader 501組胺儀檢測細胞脫顆粒能力。結(jié)果：誘導培養(yǎng)4、6周后的細胞為大小均一且具折光性的圓形懸浮細胞；甲苯胺藍染色顯示培養(yǎng)4、6周后的細胞胞核染為藍色，胞質(zhì)含有豐富的粗大紫紅色顆粒，鏡下統(tǒng)計成熟肥大細胞比例達85%以上；蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)4、6周后的細胞皆表達FcεRⅠ和CD117，其中培養(yǎng)6周的細胞FcεRⅠ表達水平更高；組胺儀檢測培養(yǎng)6周的細胞發(fā)現(xiàn)，經(jīng)濃度為100、500、1 000 μmol·L-1的鈣離子載體刺激后，與陰性對照組相比，細胞組胺釋放量依次為3.86%、17.04%及23.47%(P<0.05)，其脫顆粒具有鈣離子載體濃度依賴性。結(jié)論：獲得大量高純度的小鼠骨髓來源肥大細胞，可促進后期的組胺激發(fā)試驗及Ⅰ型變態(tài)反應機制研究。

肥大細胞； 骨髓； 組胺檢測； 誘導培養(yǎng)； 小鼠

Ⅰ型變態(tài)反應如過敏性鼻炎、過敏性哮喘、蕁麻疹、過敏性胃腸炎、過敏性休克等嚴重影響人們的健康與生活質(zhì)量。大部分Ⅰ型變態(tài)反應都是由患者體內(nèi)肥大細胞系統(tǒng)被激活而誘發(fā)的，故此，肥大細胞是參與Ⅰ型變態(tài)反應的重要效應細胞[1]。目前認為，肥大細胞驅(qū)動的Ⅰ型變態(tài)反應主要通過表達IgE高親和力FcεRⅠ受體，與過敏原特異性IgE抗體結(jié)合形成IgE/FcεRⅠ復合物，大量IgE/FcεRⅠ復合物交聯(lián)聚集，活化肥大細胞導致多種炎癥介質(zhì)和細胞因子的釋放，從而引起Ⅰ型變態(tài)反應[2]。肥大細胞是Ⅰ型變態(tài)反應的初級效應細胞，其激活直接影響次級效應細胞嗜酸粒細胞和中性粒細胞的募集和激活，盡管目前存在可以傳代的肥大細胞株，然而這些細胞系常缺乏顯著的成熟肥大細胞特性和功能[3]，因此體外誘導培養(yǎng)獲取大量高純度的肥大細胞對我們進一步研究其在Ⅰ型變態(tài)反應疾病進程中的作用有重要意義。

肥大細胞由骨髓中表達CD34和CD13抗原的多能祖細胞分化而成，廣泛分布于皮膚及內(nèi)臟黏膜下的微血管周圍，與巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞等共同構(gòu)成機體的第一道防線。白細胞介素3(IL-3)和干細胞因子(SCF)在骨髓細胞向肥大細胞的分化與活化過程中起著重要作用[4-5]。本研究旨在通過提取小鼠骨髓細胞，利用IL-3和SCF聯(lián)合作用誘導培養(yǎng)骨髓來源肥大細胞(BMMCs)并鑒定其純度與活性，為進一步研究肥大細胞激活與Ⅰ型變態(tài)反應疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)性及制定完善的Ⅰ型變態(tài)反應疾病診治方案提供實驗參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，清潔級，購自廣東省醫(yī)學動物實驗中心。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；小鼠重組IL-3、SCF購自Peprotech公司；小鼠FcεRⅠ、CD117及Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體購自Abcam公司；HR-Test組胺檢測試劑盒購自Biopharm公司。其他實驗試劑均為分析純。

1.3 小鼠骨髓來源肥大細胞的制備與培養(yǎng)

無菌環(huán)境下鈍性分離小鼠雙側(cè)股骨，剪斷股骨兩端骨骺，用1 ml注射器吸取適量RPMI 1640培養(yǎng)基將骨髓腔內(nèi)的骨髓細胞沖至無菌培養(yǎng)板中，收集液體至15 ml離心管中，1 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，用含IL-3(10 ng·ml-1)、SCF(10 ng·ml-1)和體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細胞并將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每7 d收集懸浮的細胞并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)4周和6周后分別收集細胞，對其形態(tài)及功能進行鑒定。

1.4 小鼠骨髓來源肥大細胞甲苯胺藍染色

分別收集培養(yǎng)4、6周的懸浮細胞，將細胞甩片后用1% pH 7.4的甲苯胺藍染液染約30 s，體積分數(shù)95%的酒精分色，雙蒸水洗滌，光鏡下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法分析小鼠骨髓來源肥大細胞FcεRⅠ及CD117表面分子表達

收集誘導培養(yǎng)4、6周的懸浮細胞，加入適量RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白，BCA蛋白定量后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，0.1% PBST清洗4次，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；0.1% PBST清洗2次，分別滴加稀釋后的一抗(FcεRⅠ、CD117、Tubulin)4 ℃孵育過夜；0.1% PBST清洗4次，滴加稀釋后的辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體(二抗)，室溫孵育1 h；0.1% PBST清洗2次，PBS清洗2次后滴加化學發(fā)光劑曝光。

1.6 小鼠骨髓來源肥大細胞脫顆粒能力檢測

按照HR-Test組胺檢測試劑盒說明書，使用配套試劑進行實驗。具體步驟為：在玻璃纖維板上分別加入25 μl·孔-1的pipes緩沖液、0.5% Triton X-100及不同濃度(100、500、1000 μmol·L-1)的鈣離子載體，再加入25 μl(約3000個細胞)誘導培養(yǎng)的小鼠骨髓來源肥大細胞，混勻后37 ℃孵育1 h；雙蒸水清洗5次，加入結(jié)合緩沖液75 μl·孔-1，室溫孵育10 min；加入終止緩沖液75 μl·孔-1終止反應，利用HistaReader 501組胺儀檢測肥大細胞組胺釋放量。經(jīng)0.5% Triton X-100處理的肥大細胞組胺釋放量設(shè)定為組胺最大釋放量；經(jīng)pipes緩沖液處理的肥大細胞組胺釋放量設(shè)定為組胺基礎(chǔ)釋放量。肥大細胞組胺釋放量(%)=(待測肥大細胞組胺釋放量-組胺基礎(chǔ)釋放量)/(組胺最大釋放量-組胺基礎(chǔ)釋放量)×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0軟件按以下方法對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析：實驗組與空白組之間的比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠骨髓來源肥大細胞形態(tài)學觀察

加入細胞因子IL-3、SCF培養(yǎng)72 h后開始出現(xiàn)貼壁細胞，多為長梭形，并可見大小不一的懸浮細胞(圖1A)；培養(yǎng)7 d后貼壁細胞逐漸減少，圓形懸浮細胞逐漸增多(圖1B)；培養(yǎng)4～6周，懸浮細胞大小、形狀、分布逐漸均勻且具有折光性(圖1C、D)。

圖1 光鏡下觀察不同誘導時期的細胞形態(tài)(×200) A.細胞誘導培養(yǎng)3 d； B.細胞誘導培養(yǎng)7 d； C.細胞誘導培養(yǎng)4周； D.細胞誘導培養(yǎng)6周

Fig 1 Morphology of cells under light microscope in different induced culturing periods(×200)A.Cells after 3 days’ induced culturing； B.Cells after 7 days’ induced culturing； C.Cells after 4 weeks’ induced culturing； D.Cells after 6 weeks’ induced culturing

2.2 小鼠骨髓來源肥大細胞甲苯胺藍染色

誘導培養(yǎng)4、6周后收集懸浮細胞進行甲苯胺藍染色，可見細胞胞核為藍色，大部分胞質(zhì)含有豐富的紫紅色異染顆粒(圖2)，表明所收集的細胞確有吞噬甲苯胺藍的特性，鏡下統(tǒng)計超過85%的懸浮細胞為成熟肥大細胞。

圖2 甲苯胺藍染色不同誘導時期的細胞(×1 000) A.未誘導培養(yǎng)細胞； B.細胞誘導培養(yǎng)4周； C.細胞誘導培養(yǎng)6周

Fig 2 Toluidine blue staining of cells in defferent induced culturing periods(×1 000)A.Cells without induced culturing； B.Cells after 4 weeks’ induced culturing； C.Cells after 6 weeks’ induced culturing

2.3 蛋白免疫印跡法分析小鼠骨髓來源肥大細胞FcεRⅠ及CD117分子表達

分別用細胞因子IL-3、SCF誘導培養(yǎng)4、6周后收集懸浮細胞，采用蛋白免疫印跡法分析所誘導培養(yǎng)的肥大細胞表面FcεRⅠ及CD117表達情況。誘導培養(yǎng)4、6周后，相對于未誘導的骨髓細胞，小鼠骨髓來源肥大細胞表面FcεRⅠ及CD117分子表達量明顯增多；另外與誘導培養(yǎng)4周的細胞相比，誘導培養(yǎng)6周的小鼠骨髓來源肥大細胞表面FcεRⅠ的表達水平更高(圖3)，表明誘導培養(yǎng)6周的小鼠來源肥大細胞成熟度更佳。

圖3 蛋白免疫印跡法分析不同誘導時期的細胞表面FcεRⅠ及CD117分子表達

Fig 3 Western blotting analysis of FcεRⅠand CD117 expression of cells in defferent induced culturing periods

2.4 小鼠骨髓來源肥大細胞脫顆粒能力檢測

收集誘導培養(yǎng)6周的小鼠骨髓來源肥大細胞，分別與pipes緩沖液、0.5% Triton X-100及不同濃度的鈣離子載體孵育1 h后，檢測肥大細胞組胺釋放量。結(jié)果顯示，經(jīng)濃度為100、500、1 000 μmol·L-1的鈣離子載體孵育后，與對照組相比，小鼠骨髓來源肥大細胞組胺釋放量依次為3.86%、17.04%及23.47%(P<0.05)(圖4)，表明所誘導培養(yǎng)的小鼠骨髓來源肥大細胞能被鈣離子載體活化脫顆粒釋放組胺，且具有濃度依賴性，具備良好的成熟肥大細胞活性。

aP<0.05

圖4 小鼠骨髓來源肥大細胞組胺釋放

Fig 4 Histamine release of BMMCs

3 討 論

IL-3又稱為多重集落刺激因子和造血細胞生長因子，能刺激多能干細胞和多種祖細胞的增殖與分化；SCF可增強肥大細胞的增殖、存活、分化和趨化的能力，在肥大細胞的發(fā)育和存活中起關(guān)鍵作用[6]。肥大細胞在IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應中有著至關(guān)重要的作用，而肥大細胞的細胞表面需要表達FcεRⅠ才能識別特異性IgE，進而參與Ⅰ型變態(tài)反應[7]；CD117(c-Kit)為干細胞因子受體，是另一種影響肥大細胞功能的重要受體，調(diào)控肥大細胞的生長發(fā)育，并可增強FcεRⅠ交聯(lián)引起肥大細胞脫顆粒的能力[8]，故可通過檢測肥大細胞表面FcεRⅠ和CD117的表達來對所誘導培養(yǎng)的小鼠骨髓來源肥大細胞進行鑒定[9]。本研究采用IL-3和SCF聯(lián)合刺激小鼠骨髓細胞4～6周，誘導培養(yǎng)4周后即可見大量大小均一、分布均勻且具有折光性的圓形懸浮細胞，而誘導培養(yǎng)6周的細胞，其細胞形態(tài)上與誘導培養(yǎng)4周的細胞類似。甲苯胺藍染色顯示誘導培養(yǎng)4、6周后，大部分的細胞內(nèi)皆可見粗大的、紫紅色異染性的顆粒，鏡下統(tǒng)計成熟肥大細胞比例占到85%以上；同時蛋白免疫印跡法分析顯示，誘導培養(yǎng)4、6周的肥大細胞明顯表達FcεRⅠ和CD117分子，且誘導培養(yǎng)6周的肥大細胞FcεRⅠ表達水平更高，成熟度更佳。故相比于較為傳統(tǒng)的腹腔沖洗液分離肥大細胞或磁珠分離肥大細胞獲取細胞數(shù)量有限、成本高[10]，本研究采用的骨髓細胞誘導培養(yǎng)肥大細胞的方法更為經(jīng)濟、便捷，同時保證了獲取的肥大細胞的數(shù)量、純度和成熟度。

組胺是肥大細胞內(nèi)組氨酸脫羧基后產(chǎn)生的一種胺類物質(zhì)，是肥大細胞脫顆粒的標志物質(zhì)，故檢測肥大細胞釋放組胺的量，可以了解肥大細胞活化脫顆粒情況。在肥大細胞的脫顆粒機制中，Ca+/Ca M蛋白激酶系統(tǒng)是經(jīng)典的細胞內(nèi)信息傳遞系統(tǒng)，Ca+內(nèi)流使細胞內(nèi)Ca+濃度升高，從而導致組胺釋放增加[11]。本研究將誘導培養(yǎng)的肥大細胞與不同濃度的Ca+載體共孵育，激活Ca+/Ca M蛋白激酶系統(tǒng)導致肥大細胞釋放組胺，通過HistaReader 501組胺儀直接檢測肥大細胞組胺的釋放量。結(jié)果顯示，與對照組相比，與鈣離子載體孵育后，誘導的肥大細胞皆可釋放組胺且組胺釋放量與鈣離子載體濃度成正比，表明本研究中誘導培養(yǎng)的小鼠骨髓來源肥大細胞具有良好的活性。另外，組胺半衰期短，容易降解，故能否及時而準確地檢測組胺是影響Ⅰ型變態(tài)反應診治的不可忽視的因素。本研究使用HistaReader 501組胺儀直接檢測肥大細胞組胺釋放情況，敏感性較好且步驟簡單、用時短，具有良好的使用前景，為更好地利用組胺激發(fā)試驗，研究肥大細胞在Ⅰ型變態(tài)反應中的作用提供參考。

[1] GUILLEN D，F(xiàn)IANDOR-ROMAN A，CABALLERO T，et al.Urticaria caused by ingestion of pasta and bread containing buckwheat flour[J].J Investig Allergol Clin Immunol，2013，23(3):206-207．

[2] HONG G U，LIM J Y，KIM N G，et al.IgE and IgA produced by OX40-OX40L or CD40-CD40L interaction in B cells-mast cells re-activate FcepsilonRI or FcalphaRI on mast cells in mouse allergic asthma[J].Eur J Pharmacol，2015，754:199-210．

[3] 李洪濤.銅綠假單胞菌Quorum Sensing信號分子N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone對肥大細胞作用研究[D].武漢：華中科技大學，2009．

[4] OLIVEIRA S H，LUKACS N W.Stem cell factor：a hemopoietic cytokine with important targets in asthma[J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2003，2(4):313-318．

[5] IRSNI A M，NILSSON G，MIETTINEN U，et al.Recombinant human stem cell factor stimulates differentiation of mast cells from dispersed human fetal liver cells[J].Blood，1992，80(12):3009-3021．

[6] HAIG D M，HUNTLEY J F，MACKELLAR A，et al.Effects of stem cell factor (kit-ligand) and interleukin-3 on the growth and serine proteinase expression of rat bone-marrow-derived or serosal mast cells[J].Blood，1994，83(1):72-83．

[7] EL-AGAMY D S.Targeting c-kit in the therapy of mast cell disorders：current update[J].Eur J Pharmacol，2012，690(1-3):1-3．

[8] GILFILLAN A M，BEAVEN M A.Regulation of mast cell responses in health and disease[J].Crit Rev Immunol，2011，31(6):475-529．

[9] DEPINAY N，HACINI F，BEGHDADI W，et al.Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites[J].J Immunol，2006，176(7):4141-4146．

[10] SORURI A，GRIGAT J，KIAFARD Z，et al.Mast cell activation is characterized by upregulation of a functional anaphylatoxin C5a receptor[J].BMC Immunol，2008，9:29．

[11] LAW M，MORALES J L，MOTTRAM L F，et al.Structural requirements for the inhibition of calcium mobilization and mast cell activation by the pyrazole derivative BTP2[J].Int Biochem Cell Biol，2011，43(8):1228-1239．

Induced culture and functional identification of mouse bone marrow-derived mast cell

SHI Ren-ren，WANG Shan，HE Ying，ZOU Ze-hong，ZHANG Ke-jun，LI Lin-mei，XIAO Chun-mei，GUAN Zhi-ao，TAO Ai-lin

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofAllergy&ClinicalImmunology，TheStateKeyClinicalSpecialtyinAllergy，TheStateKeyLaboratoryofRespiratoryDisease，TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity，Guangzhou510260，China)

Objective: To investigate induced culture methods of bone marrow-derived mast cells(BMMCs) to provide materials for allergen challenge assay. Methods: BMMCs were differentiated from bone marrow cells cultured for 4 to 6 weeks with interleukin-3(IL-3) and stem cell factor (SCF) supplemented. The cell features were characterized by light microscopy and toluidine blue staining. The maturity of the cells was investigated by analyzing the membrane markers FcεRⅠand CD117 by Western blotting， and potency of BMMCs was calculated through histamine release assay by HistaReader 501 instrument. Results: The induced BMMCs， all in uniformed size with refraction， were observed to be filled with typical purple granules. The mature mast cells accounted for more than 85% of all cells. FcεRⅠand CD117 were positively expressed in BMMCs and FcεRⅠwere more expressive after 6 weeks of culture. The rate of histamine release by BMMCs cultured for 6 weeks were 3.86%， 17.04% and 23.47% (P<0.05) after stimulated with calcium ionophore at concentrations of 100， 500 and 1 000 μmol·L-1， compared to control group. Conclusion: A large amount of highly purified BMMCs have been obtained， which will facilitate the subsequent allergen challenge assay and mechanism research on typeⅠallergy．

mast cell； bone marrow； histamine detection； induced culture; mice

2015-05-15

2015-05-25

國家科技重大專項重點項目(2014ZX08011-005B)；國家自然科學基金資助項目(81373128)；國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(520102)

石任任(1987-)，女，廣東佛山人，在讀碩士研究生。E-mail:doreen87@163.com

陶愛林 E-mail:aerobiologiatao@163.com

石任任，王珊，何穎，等.小鼠骨髓來源肥大細胞的誘導培養(yǎng)及功能鑒定[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2015，34(5)：684-688．

Q813.11

A

1671-6264(2015)05-0684-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.05.002