袁孔現(xiàn)　毛名揚(yáng)　詹三華

HPLC測定血清中丙戊酸濃度質(zhì)控方法的研究

袁孔現(xiàn)毛名揚(yáng)詹三華

【摘要】目的建立使用HPLC測定血清中丙戊酸濃度的質(zhì)控方法，保證監(jiān)測的準(zhǔn)確性和可靠性。方法使用含丙戊酸質(zhì)控血清，與患者血清同步測定，比照兩者測定結(jié)果計算患者血清中丙戊酸濃度。結(jié)果含丙戊酸質(zhì)控血清穩(wěn)定性良好，日內(nèi)、日間RSD均小于6．0%，回收率為96．0%～106．2%，有效保證血樣中丙戊酸濃度的監(jiān)測。結(jié)論

使用質(zhì)控血清參照法測定丙戊酸血清濃度方法快速、簡便、準(zhǔn)確性好，可靠性高，適用于臨床進(jìn)行丙戊酸的治療藥物監(jiān)測。

【關(guān)鍵詞】丙戊酸;藥物監(jiān)測;質(zhì)量控制;高效液相色譜法

作者單位: 244000安徽省銅陵市人民醫(yī)院

丙戊酸是一種結(jié)構(gòu)與卡馬西平、苯妥英、苯巴比妥不相關(guān)的不含氮的抗癲癇藥物，化學(xué)名稱為2-丙基戊酸，1881年合成，最初被作為有機(jī)溶劑使用，1963年肯定其具有抗癲癇作用。目前丙戊酸也被用于各種精神疾病和偏頭痛的治療，丙戊酸的治療反應(yīng)通常在血清濃度達(dá)到或大于40 mg/L時出現(xiàn)，當(dāng)血清濃度超過100 mg/L時就能發(fā)生藥物中毒［1］。丙戊酸治療濃度窗口較窄，體內(nèi)過程和療效個體差異較大，進(jìn)行治療藥物監(jiān)測能夠最大程度控制病情，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。對于血液樣本的準(zhǔn)確測定能為判斷分析療效及制定個體化給藥方案提供可靠依據(jù)，使用質(zhì)控血清進(jìn)行監(jiān)測參照能夠有效保證血液樣本測定的準(zhǔn)確性，減少單次測定時頻繁加樣帶來的誤差。

1　材料與試劑

1．1儀器高效液相色譜儀，包括四元泵LC-20AD、在線脫氣機(jī)DGU-20A5、紫外檢測器SPD-20AV、柱溫箱CTO-20A、HPLC色譜工作站(日本島津公司)。MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋)，萬分之一電光分析天平(上海儀器廠)。

1．2試劑丙戊酸鈉對照品(江蘇恒瑞制藥廠提供，批號: 20080611，99．2%)、特級新生牛血清(蘭洲民海生物工程有限公司，批號: 20100310)、環(huán)已烷羧酸( Geel，Belgium，Lot: A010002801，98 + %)、2-溴苯乙酮( Geel，Belgium，Lot: A017996101，98%) ;甲醇、乙腈、正戊烷均為色譜純(美國TEDIA公司)，三乙胺為化學(xué)純，試驗用水為實驗室自制重蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2．1色譜條件色譜柱Kromasil 100A C18 ( 150 mm LD×4．6 mm ID，5 μm) ;流動相:乙腈－試驗用水( 70∶30，v∶v) ;檢測波長: 248 nm;流速: 1．0 ml/min;柱溫: 40℃;進(jìn)樣量: 20 μl。定量方法:內(nèi)標(biāo)－峰面積積分法。

2．2試液的制備VPA質(zhì)控血清精密稱取48．00 mg 經(jīng)105℃干燥恒重的丙戊酸鈉對照品置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成含丙戊酸1 659 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。溶解均勻后精密吸取5．0 ml 置100 ml容量瓶中，水浴蒸去大部分甲醇，加特級新生牛血清至刻度，充分溶解均勻后即制得含VPA 82．96 mg/L的質(zhì)控血清，分裝成1 ml小包裝后密封冷凍備用。內(nèi)標(biāo)及衍生試劑精密稱取12．5 mg環(huán)已烷羧酸置100 ml容量瓶中，加乙腈至刻度，配制成125．0 mg/L的環(huán)已烷羧酸/乙腈內(nèi)標(biāo)溶液;精密稱取100．0 mg的2-溴苯乙酮置100 ml容量瓶中，加乙腈至刻度，配制成1．0 g/L的2-溴苯乙酮/乙腈衍生試劑; 取20 ml三乙胺，加80 ml乙腈配制成20%的三乙胺/乙腈( v∶v)溶液為反應(yīng)催化劑。所用試劑配制后置4℃冰箱中避光冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2．3血樣處理和色譜行為取出冷凍質(zhì)控血清，自然解凍至室溫，精密吸取100 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl、1 mol/L硫酸50 μl，混勻;加入正戊烷4 ml，渦旋提取1 min，靜置5 min，轉(zhuǎn)移上清液至潔凈玻璃管中，加1．0 g/L的2-溴苯乙酮/乙腈衍生試劑50 μl、催化劑20%三乙胺/乙腈溶液50 μl，置60～65℃水浴中避光反應(yīng)10 min，N2吹干。殘渣用100 μl乙腈溶解，取20 μl溶液進(jìn)樣。環(huán)已烷羧酸衍生物峰值時間為3．980 min、丙戊酸衍生物峰值時間為6．040 min。兩者丙戊酸和內(nèi)標(biāo)色譜峰分離良好，峰形正常，較少拖尾，完全達(dá)到基線分離，患者血清色譜圖中出現(xiàn)的雜質(zhì)峰不影響主峰的積分計算。見圖1。

2．4樣品丙戊酸濃度依據(jù)患者血清圖譜中丙戊酸衍生物峰與內(nèi)標(biāo)衍生物峰積分值的比值，參照質(zhì)控血清圖譜中兩峰值比及質(zhì)控血清中丙戊酸濃度計算患者

血清中丙戊酸濃度。

圖1　HPLC色譜圖

2．5方法學(xué)考察

2．5．1精密度試驗:取空白血清100 μl×1份，精密加入丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μl，另取質(zhì)控血清樣本100 μl ×3份，按“2．3項”步驟檢測，以加樣血清樣本為基準(zhǔn)，計算質(zhì)控血清樣本內(nèi)丙戊酸濃度，取平均值，計算日內(nèi)精密度;在同一周內(nèi)，每天測定1次，連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。結(jié)果日內(nèi)、日間的RSD值均小于6．0%，回收率為96．6%～106．2%。

2．5．2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取空白血清100 μl，加入丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度梯度為8．30、16．59、33．18、66．37、132．74 mg/L的含丙戊酸血清樣本。按2．3項操作，參照質(zhì)控血清測算樣本中丙戊酸濃度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度( X)為橫坐標(biāo)、實際測得加樣血清中丙戊酸濃度( Y)為縱坐標(biāo)，得回歸方程Y = 0．9543 X－1．2959，r = 0．9994。結(jié)果表明，使用質(zhì)控血清參照，血清丙戊酸濃度在8．30～132．74 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，測量結(jié)果準(zhǔn)確。

2．5．3穩(wěn)定性試驗:將質(zhì)控血清反復(fù)冷凍(－20℃)、解凍，按“2．3項”步驟處理，與新鮮配制的加樣血清進(jìn)行比對，結(jié)果顯示質(zhì)控血清在反復(fù)凍融期間穩(wěn)定性良好。

2．5．4專一性試驗:考慮到臨床治療過程中，合用藥物有可能對本試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾，在擬訂血樣處理方法和色譜條件下，對幾種在治療癲癇時可能合用的藥物，如卡馬西平、苯妥英鈉、地西泮、硝西泮、苯巴比妥等進(jìn)行分析比較。結(jié)果這些藥物在同等條件下出峰位置靠前，大約在3 min內(nèi)完成出峰，如卡馬西平出峰時間為1．82 min，地西泮出峰時間為2．69 min。對丙戊酸衍生物和內(nèi)標(biāo)衍生物出峰位置無干擾，不影響丙戊酸血藥濃度的測定。

2．6樣品測定使用質(zhì)控血清對臨床科室提供的30份患者血清樣本進(jìn)行即時測定，其中丙戊酸濃度低于40 mg/L的有6份，處于40～100 mg/L正常治療濃度范圍的有21份，高于100 mg/L的有3份。丙戊酸藥物濃度監(jiān)測有效地協(xié)助臨床醫(yī)師及時調(diào)整治療方案，保證治療效果，防止藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

3　討論

文獻(xiàn)報道的方法大都采用標(biāo)準(zhǔn)溶液臨時加樣法，標(biāo)準(zhǔn)溶液在使用過程中容易吸濕或溶劑蒸發(fā)，冷藏期間也會發(fā)生降解，需要經(jīng)常性進(jìn)行標(biāo)定或重新配制，難以保證檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性［2，3］。使用冷凍質(zhì)控血清對患者血樣進(jìn)行檢測，由于冷凍質(zhì)控血清穩(wěn)定性較高［4］，能有效保證血樣檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

丙戊酸分子結(jié)構(gòu)中不含紫外特征吸收基團(tuán)，不能用高效液相色譜－紫外檢測法直接測得，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在有機(jī)酸基團(tuán)上接入有紫外吸收的2－溴苯乙酮基團(tuán)進(jìn)行檢測是本法的關(guān)鍵，也是選擇環(huán)已烷羧酸作為內(nèi)標(biāo)物的基礎(chǔ)，兩者結(jié)構(gòu)相近，化學(xué)性質(zhì)基本相同。

實驗所用的試劑保存期間需特別注意，所用試劑溶液均需避光、冷藏保存，包括1 mol/L稀硫酸溶液，在我實驗室長期檢測工作中，發(fā)現(xiàn)稀硫酸在室外光照情況下會產(chǎn)生雜質(zhì)，檢測時出現(xiàn)異常峰，干擾試驗結(jié)果。2-溴苯乙酮溶液在光照的情況下會迅速降解，降低衍生反應(yīng)程度，嚴(yán)重影響檢測效果。

文獻(xiàn)報道衍生反應(yīng)溫度為50～55℃［2，3］，本實驗采用60～65℃水浴中完成衍生反應(yīng)，相比較發(fā)現(xiàn)升高反應(yīng)時溫度會改善反應(yīng)效率，使丙戊酸衍生物和環(huán)已烷羧酸衍生物的響應(yīng)值提高。在夏天氣溫高時，衍生反應(yīng)結(jié)束、N2吹干后，可用自來水沖淋試管外壁，以期迅速降低試管溫度，避免在自然降溫情況衍生產(chǎn)物發(fā)生降解，影響檢測結(jié)果。

流動相使用乙腈－實驗用水( 70∶30，v∶v)，用乙腈替代甲醇［5］。由于乙腈的黏度低于甲醇，可以減小實驗過程中產(chǎn)生的液壓，降低實驗設(shè)備負(fù)荷。也可以通過調(diào)整乙腈－實驗用水的比例來適應(yīng)色譜分析柱和修正圖譜峰形，當(dāng)換用250 mm色譜柱時可增加流動

相中乙腈比例，以確保單組分析在10 min內(nèi)完成。

在日常檢測工作中我們發(fā)現(xiàn)，成人使用丙戊酸鈉緩釋片(德巴金，500 mg/片)口服，1～2次/d，能很好地控制藥物治療濃度和病情，而小兒使用的丙戊酸鈉溶液劑(德巴金)，1～2次/d不能有效控制病情，服藥期間藥物濃度峰-谷差值較大，容易出現(xiàn)嗜睡(峰值時)和病情發(fā)作(谷值時)的情況。究其原因，丙戊酸鈉緩釋片在胃內(nèi)僅少量釋放，在腸道內(nèi)緩慢吸收，達(dá)峰時間較長，峰濃度較低，峰-谷差值較小。而丙戊酸鈉溶液劑口服后在胃內(nèi)迅速吸收，1 h內(nèi)達(dá)峰值，生物利用度近100%［6］。因此建議小兒在使用丙戊酸鈉溶液劑(德巴金)時，可將每日總劑量分3～4次服用，嚴(yán)格掌握用藥劑量和時間間隔，以期降低丙戊酸峰濃度，最大程度控制病情，減少藥物不良反應(yīng)和峰-谷濃度差。

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·藥物研究·

收稿日期:( 2014－09－09)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．054

【中圖分類號】R 917

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0613－03