李亞男李春雨

（1.遼寧省風沙地改良利用研究所,遼寧阜新 123000；2.阜新高等?？茖W校,遼寧阜新 123000）

利用抑制消減雜交技術鑒定綿羊肉質性狀相關ESTs

李亞男1李春雨2*

（1.遼寧省風沙地改良利用研究所,遼寧阜新 123000；2.阜新高等?？茖W校,遼寧阜新 123000）

肌肉品質的遺傳改良是當前畜禽育種的主要任務之一，本研究采用抑制消減雜交（SSH）技術構建不同肉用綿羊品種（道賽特與小尾寒羊）以及雜交親代與子代（小尾寒羊與薩寒雜交羊）背最長肌的正反向消減cDNA文庫，并分離差異表達EST，進行差異表達基因的全長cDNA與基因組DNA的克隆、時空表達分析，從而找到有價值的基因作為綿羊肉質性狀的候選基因，并從基因表達水平上揭示不同肉用綿羊品種肉質性狀差異和雜種優(yōu)勢的遺傳基礎，為綿羊基因組學的研究增加新的內容，為綿羊肉質性狀的分子標記輔助選擇、優(yōu)質肉羊新品種或品系培育提供科學依據，為雜種優(yōu)勢分子預測提供新途徑和方法。

1 主要內容及研究方法

1.1 不同肉羊品種以及雜交親代與子代背最長肌的正反向消減cDNA文庫的構建

本研究以遼寧省阜新市阜瑤牧業(yè)有限公司種羊場飼養(yǎng)的肉用綿羊為研究對象，采用抑制消減雜交（SSH）技術構建道賽特和小尾寒羊背最長肌的正反向消減cDNA文庫、小尾寒羊克和薩寒雜交羊背最長肌的正反向消減cDNA文庫。以管家基因B-actin作為消減指標，對每個消減文庫的消減效率進行檢測。

1.2 不同肉羊品種以及雜交親代與子代背最長肌的正反向消減cDNA文庫的篩選

采用PCR和斑點雜交的方法從構建好的消減文庫中篩選陽性克隆。對鑒定為差異的克隆進行測序，獲得的ESTs經過去載體和拼接，與非冗余蛋白質數(shù)據庫進行 BLASTx 比對分析。

根據所獲得的差異表達EST序列設計引物，采用RT-PCR方法對其差異表達的真實性進行驗證，并進行生物信息學分析，找出與肉質性狀相關的基因。

1.3 差異基因全長克隆及序列分析

對所獲得的差異表達EST進行電子延伸，再根據電子延伸所獲得的連續(xù)體或重疊群設計上游和下游引物。以SMART cDNA為模板，用下游引物和SMART 5’引物擴增基因的5’端，用上游引

按照黨中央、國務院和云南省委、省政府關于生態(tài)文明建設和決戰(zhàn)脫貧攻堅的決策部署，緊密聯(lián)系林業(yè)現(xiàn)代化建設和改革發(fā)展實際，圍繞增綠、增質、增效和提供更多優(yōu)質生態(tài)產品以滿足人民日益增長的優(yōu)美生態(tài)環(huán)境需要的目標，云南省對林業(yè)供給側結構性改革和配套措施的探索，長期走在國內前列。

物和SMART3’引物擴增3’端，然后測序拼接，獲取基因的全長cDNA序列，并利用生物信息學方法對其特征進行分析。

1.4 差異基因時空表達規(guī)律分析

差異基因的不同品種間表達分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在德國肉用美利奴、道賽特、薩福克、小尾寒羊間的表達情況。

差異基因的不同發(fā)育階段表達分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在羊各發(fā)育階段（2、4、6、8、10、12月齡）的表達情況。

差異基因的不同組織表達分析：以管家基因β-actin作為對照，利用各差異基因特異引物分析差異基因在背最長肌、股二頭肌、半棘肌、脂肪、心、肝、脾、肺、腎、胰、小腸、胃、子宮、卵巢、睪丸等組織中的表達情況。

2 主要研究成果

2.1 構建了2個肉用綿羊SSH 文庫

構建了道賽特與小尾寒羊、薩寒雜交羊與小尾寒羊正反向消減cDNA文庫。對構建的文庫進行的差減效率檢測結果表明：看家基因β-actin在沒有消減組出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)是23，在消減組出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)是28，說明構建的差異表達基因文庫的效率均是25倍，同時也表明所構建的消減文庫中測試組和驅動組中共有的cDNA片斷被有效雜交，差異表達于肌肉組織中的基因得到有效的富集。

2.2 篩選出9個肉質性狀相關候選基因ESTs

以 T7 和 SP6 通用引物進行文庫篩選，結果顯示插入片段主要分布在 250～2000bp 之間，呈隨機分布，其中一部分克隆的 PCR電泳結果說明構建的正反向差異表達基因的文庫質量良好。對鑒定為差異的克隆進行測序比對，差異表達驗證和生物信息學分析，篩選出9個肉質性狀相關的具有重要功能的候選基因ESTs，如表1所示。

表1 從SSH文庫篩選的肉質性狀相關基因一覽表

2.3 獲得4個肉質性狀相關差異基因全長cDNA序列

對所獲得的差異表達ESTs進行電子延伸，設計引物，擴增得到4條基因全長cDNA序列。對其特征分析表明其參與調控肌肉肌苷酸合成等生理過程，與綿羊肉質風味性狀緊密相關。

2.4 差異基因時空表達規(guī)律分析

利用克隆的4個基因特異引物分析差異基因在德國肉用美利奴、道賽特、薩?？?、小尾寒羊間、在羊各發(fā)育階段和不同組織的表達情況，部分差異基因表達如圖所示。

圖1 ADSL基因在8種組織中的差異表達分布圖1-8分別為心、肝、脾、肺、腎、腦、腿肌和胸肌

3 研究成果的科學意義和應用前景

本研究成果為研究肉用綿羊肉質性狀提供了基因水平的基礎，能夠有效推動具有我國特殊肉質性狀肉用綿羊的研究進程，進而加強具有我國獨特性狀的綿羊品種的開發(fā)與利用，創(chuàng)造出廣泛的社會及經濟價值。

本課題所采用的理論和方法研究羊肉質風味性狀的相關基因，篩選和鑒定一批對肉質性狀有重要作用的功能基因，應用分子生物學、基因組學的理論與技術進行分子標記輔助選擇來選種、育種，獲得更符合市場需求的優(yōu)良肉羊品種。一方面，項目中若干技術可以成為品種分子設計的基礎研究手段，提高我省肉用綿羊育種工作的原始創(chuàng)新能力，另一方面，本研究也為相關育種從經驗型向精確型轉變，使我省綿羊育種工作建立在分子遺傳學及相關學科先進理論和技術的基礎上[2，3]，為提升綿羊育種的技術水平和育種效率奠定堅實的理論基礎。

[1] 胡鵬飛，張貴學，于國慶，等.羔羊卵泡誘導發(fā)育、活體采卵和體外發(fā)育潛能研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，2011，42（2）：182-189.

[2] 胡鵬飛，李曉東，戴偉，等.不同水系絨螯蟹線粒體DNA 的遺傳差異和群體遺傳多樣性研究[J].華北農學報，2008，23（3）：50-55.

李亞男（1980-），女，助理研究員，本科，研究方向為獸醫(yī)臨床診療及畜牧生產技術。

李春雨（1981-），男，講師、國家執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，本科，研究方向為臨床獸醫(yī)學、高職畜牧獸醫(yī)專業(yè)教學改革。