陳龍彪， 高曉云， 吳宇陽， 馮亞瓊， 陳紅英， 崔保安， 馬世杰， 郭官鵬

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州 450002)

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豬細小病毒河南分離株全基因組克隆及序列分析

陳龍彪， 高曉云， 吳宇陽， 馮亞瓊， 陳紅英， 崔保安*， 馬世杰， 郭官鵬

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州 450002)

[目的]進一步了解河南地區(qū)豬細小病毒(PPV)的變異特點。[方法]利用PCR方法，對河南鄭州、周口、濟源等地采集的疑似PPV感染的病料進行檢測。PCR檢測為陽性的病料經(jīng)處理后，同步接種豬睪丸細胞盲傳6代，對4株PPV全基因組進行分段克隆及測序，并與GenBank登錄的國內(nèi)外PPV流行株全基因組進行比較。[結(jié)果]獲得的4株PPV全基因組序列全長均為4 679 bp。4個毒株之間的核苷酸同源性介于99.6%～99.8%，與其他毒株間核苷酸同源性為98%～100%，遺傳進化較為穩(wěn)定。[結(jié)論]為PPV在河南地區(qū)分子流行病學調(diào)查及遺傳變異分析奠定了基礎。

豬細小病毒；全基因組；克??；序列分析

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，主要表現(xiàn)為胎兒和胚胎的感染和死亡。受感染母豬會產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，而受感染母豬本身通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。仔豬會出現(xiàn)生長受阻，同時伴有仔豬的皮炎和腹瀉癥狀。感染公豬則表現(xiàn)為精液品質(zhì)下降。PPV 又常同豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)等混合感染而加重其危害[1]。同時，PPV對熱極其穩(wěn)定，對很多常用消毒劑都具有很強的抵抗力，因此污染的豬舍常是PPV的主要儲藏所，導致該病的流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。

自1967年Cartwright等[2]首次從豬流產(chǎn)胎兒臟器中分離到PPV以來，各國豬群血清學調(diào)查陽性檢出率都較高，我國血清學調(diào)查的陽性率為80%[3-5]，其中有些豬場經(jīng)產(chǎn)母豬和5日齡內(nèi)仔豬PPV的HI陽性率高達99%～100%。我國先后在北京、上海、吉林、四川、浙江等地分離到多株PPV，這些PPV毒株雖然分離自不同地區(qū)，但都屬于同一血清型。

近年來，因PPV感染而造成的危害呈上升趨勢。為了解河南地區(qū)PPV的變異特點，筆者從河南鄭州、周口、濟源、焦作等地采集疑似感染PPV的病料中分離出4株PPV，測序4毒株的全基因組序列，并與GenBank登錄的PPV參考毒株進行遺傳進化分析，旨在為進一步分析PPV基因組的結(jié)構(gòu)、功能以及PPV防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織病料及細胞株將2010～2012年從河南鄭州、周口、濟源、焦作等疑似PPV感染發(fā)病的豬中采集死胎胎衣及肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織，-80 ℃保存?zhèn)溆?。豬睪丸(ST)細胞購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑TaqTM酶、蛋白酶 K、pMD-18載體等購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購自Promega公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購自Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海生物工程有限公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 引物的設計與合成參考GenBank已發(fā)表的PPV序列[6]，設計并合成4對相互重疊的特異引物(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 組織病料中PPV DNA的PCR檢測將采集的死胎胎衣及肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織混合，剪碎后研磨成勻漿，按1∶5(W/V)加入滅菌PBS液，制成懸液，反復凍融3次后，融化，8 000 r/min離心10 min。取上清液200 μl，按常規(guī)的酚氯仿抽提法提取病毒DNA。利用PPV檢測引物[7]，PCR檢測PPV DNA。取5 μl PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)進行電泳檢測PCR的結(jié)果。

1.5 病毒的分離與培養(yǎng)將PCR檢測為陽性的病料，剪成小塊并研碎凍融3次，加入少量DMEM培養(yǎng)液稀釋，5 000 r/min 離心10 min，在上清液中加入青霉素1 000 U/ml和鏈霉素1 000 U/ml，37 ℃作用2 h，經(jīng)0.22 μm的細菌濾器過濾除菌。將處理后的病料按培養(yǎng)液量的10%同步接種到ST細胞中，置于5%CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收獲接毒細胞，反復凍融3次收集病毒，8 000 r/min離心30 min去除細胞碎片，此為第一代毒。盲傳至ST細胞出現(xiàn)較穩(wěn)定的細胞病變(CPE)時，按2%進行接毒[8]，連續(xù)盲傳至第6代。傳代過程中，觀察細胞病變，直至收獲病毒，并用PPV檢測引物，PCR檢測PPV[8-9]。

表1 所用引物

1.6 DNA片段的克隆、鑒定和測序?qū)PV分離株感染的ST細胞毒，凍融3次，12 000 r/min離心4 min。取上清，按“1.4”方法抽提細胞毒DNA。利用表1中PPV特異引物進行PCR擴增，將回收純化的DNA片段克隆于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。PCR和酶切鑒定為陽性的重組菌，送上海生工生物工程有限公司進行測序[10-12]。

1.7 PPV全基因組序列分析利用DNAstar軟件包進行PPV全基因組序列拼接，并對PPV分離株全基因組序列及由ORF所推導的氨基酸序列與GenBank上讀取的PPV參考毒株(表2)序列進行分析，分析它們之間的同源性及變異程度。

表2 PPV參考毒株的國家、采樣時間、全基因組長度及登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV的細胞培養(yǎng)將PCR檢測為PPV陽性的鄭州、周口、濟源、焦作等地組織勻漿液接種ST細胞，盲傳6代，分離到4株PPV。從各代次中均檢測出PPV特異性的目的片段，而正常ST細胞核酸為模板進行PCR擴增，結(jié)果為陰性。表明病毒已適應ST細胞。將分離出的4株PPV分別命名為G、H、I和K。

2.2 PPV基因組的克隆與序列測定用所設計的4對引物P1/P2、P3/P4、P5/P6和P7/P8進行PCR擴增，電泳結(jié)果顯示，分別擴增出約1 600、1 500、700和1 900 bp的條帶(圖1)，與預期擴增產(chǎn)物大小相符。每個分離株4個基因片段大小分別為1 608、1 482、675和1 857 bp，與預期產(chǎn)物大小一致。經(jīng)拼接獲得的4個分離株全基因組序列均為4 679 bp。所測序列已上傳NCBI，獲得序列登錄號分別為KF429252、KF429253、KF429254、KF429255。

2.3 PPV全基因組序列分析利用DNAstar軟件，將4株PPV與GenBank收錄的具有代表性的PPV全序列進行序列分析。4個分離株之間的核苷酸同源性為99.6%～99.8%，所有PPV株基因組間核苷酸同源性在98%～100%。由圖2可知， I和K株與NADL-2(M38367.1、NC_001718.1)株、中國分離株JT(JN968975.1)的親緣關系較近，而G株和H株與廣西分離株N(HM989009.1)親緣關系較近(圖2)。

2.4 PPV NS1基因及推導的氨基酸分析利用DNAstar軟件將PPV NS1基因及所推導的氨基酸序列進行比對，并繪制進化樹。所有PPV株NS1基因核苷酸序列同源性位于98.1%～100%。4株分離株處于同一分支，與NADL-2株的親緣關系較近(圖3)。其推導的氨基酸序列同源性在98.2%～100%，僅存在個別氨基酸差異：G、I、K株在59位N→D，K株在155位S→G，I株在173位K→E，G、H、I株在513位N→H。

2.5 PPV VP1基因及推導的氨基酸分析利用DNAstar軟件將PPV各毒株的VP1基因及所推導的氨基酸序列進行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有PPV株VP1基因核苷酸序列同源性位于98.6%～100%，推導的氨基酸序列同源性在98.%～100%。與參考毒株NADL-2相比，4株PPV與一些PPV毒株相同，在219、318、539、730和739位點發(fā)生氨基酸置換(219-→Y，318R→S，539-→L，730L→I和739K→E)，而分離株在37、352和388等位點出現(xiàn)了獨特的突變(表3中斜體下劃線標示)，但無一定規(guī)律性。

表3 PPV各毒株VP1蛋白的氨基酸差異

接下表

續(xù)表3

注：與參考毒株NADL-2 (NC_001718)的氨基酸序列相比，相同的用“.”做標記，不編碼氨基酸的位點用“-”表示。

2.6 VP2基因及推導的氨基酸分析利用DNAstar軟件將各分離株的VP2基因及所推導的氨基酸序列進行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有PPV株VP2基因核苷酸同源性位于98.3%～100%，變異較小，沒有發(fā)生插入或移位突變，僅存在點突變。其推導的氨基酸序列同源性在97.1%～100%，突變位點在45S→T，144E→A，378G→D，555N→K，565K→R較為一致。而分離株在其他位點，如178、214、320等位點出現(xiàn)了獨特的突變(表4中斜體下劃線標示)，但無一定規(guī)律性。

表4 PPV各毒株VP2蛋白的氨基酸差異

注：與參考毒株NADL-2 (NC_001718)的氨基酸序列相比，相同的用“.”做標記，不編碼氨基酸的位點用“-”表示。

3 討論

豬細小病毒全長約5 000 bp，成熟的粒子只含有負鏈DNA。PPV與其他自主性細小病毒相似，兩端均有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3′端的102nt的回文序列被其中的2個10nt的短回文序列中斷，折疊形成Y型結(jié)構(gòu)；5′端有一個127nt的回文序列，中間被一個24nt的短回文序列中斷，折疊形成U型結(jié)構(gòu)[13]。這種復雜的末端結(jié)構(gòu)導致PCR方法只能對PPV的編碼基因進行擴增。一般認為細小病毒都較保守，而按照實驗室建立的PPV檢測和分離鑒定方法得到的這4個分離株在核苷酸序列上同其他毒株差別不大，該研究結(jié)果證實了這一點。但基于遺傳和變異的特性，即使很細微的點突變長期積累下來也會造成較大的變化。

近年來對于PPV的研究主要集中于結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1上，對于其他基因的研究很少，而研究表明其他部分基因在PPV的復制、傳播過程中同樣起著至關重要作用。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒DNA的復制中起著重要作用，是病毒基因組本身編碼的反式激活蛋白，對病毒的早期和晚期轉(zhuǎn)錄都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，起始病毒DNA的復制，與細小病毒的組裝密切相關。從NS1蛋白的核苷酸序列進化樹可以看出，這4株PPV的NS1蛋白在一個分支上，相似性非常高，符合其應具有的高度保守性。而對NS2和NS32這2個非結(jié)構(gòu)蛋白的報道較少，因此其功能尚不清楚。

結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3共同構(gòu)成了病毒的核衣殼，其中VP1可能在病毒從細胞外轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)起作用，據(jù)報道抗VP1血清抗體保護率(100%)比VP2、VP3血清抗體(保護率50%～70%)具有更強的中和病毒能力[14]。而VP2蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的保護性抗原，在體外表達后不僅有良好的免疫原性而且可以自我裝配成病毒樣顆粒，將該顆粒接種動物后能誘導產(chǎn)生強烈的免疫應答反應[15]。VP3通常認為是VP2翻譯后切割加工的產(chǎn)物。通過對VP1和VP2基因序列以及氨基酸序列的分析可以發(fā)現(xiàn)，該次獲得的4株PPV基因變異不大，沒有出現(xiàn)一定規(guī)律的突變點，符合PPV病毒的保守性特點，而VP1蛋白和VP2蛋白核苷酸序列進化樹形態(tài)較為相似：I、K株同NADL-2 (美國，M38367.1、NC_001718.1)弱毒侏關系較近，而G、H株同N(中國廣西，HM989009.1)關系較近。同時4株分離株都具有VP1/VP2終止子處的兩段完整127 bp重復單元，符合PPV弱毒的特征[13]。但從2種蛋白的推導氨基酸進化樹上可以看出，盡管核苷酸序列的相似度較高，但氨基酸序列的差異較大。由此可見，PPV的變異應屬于基因漂移而發(fā)生的改變，與地域及藥物選擇沒有直接的相關性，而對于PPV基因漂移對抗原性的影響還有待進一步研究[16]。

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Cloning and Sequence Analysis of the Complete Genome of Porcine Parvovirus from Henan Province

CHEN Long-biao，GAO Xiao-yun，WU Yu-yang, CUI Bao-an*et al

(College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan 450002)

[Objective] Sample suspiciously infected with porcine parvovirus(PPV)were collected from several regions in Henan Province and detected by PCR. [Method]Positive cases were treated and inoculated in swine testicular (ST) cells, 4 isolates were isolated and passaged blindly in ST cell for 6 generations. According to the published complete genome sequences of PPV in GenBank, a pair of specific primers was designed and synthesized.The complete genomes of the PPV isolates were cloned，sequenced and analyzed.[Result] The results showed that the genomes homologies among the 4 isolates were 99.6%-99.8%，and they shared 98%-100% homologies with other PPV strains.Phylogenetic tree showed that the 4 PPV isolates were closely related.[Conclusion]The study provided some basis for studying the molecular epidemiology，variation and prevention of PPV in Henan.

Porcine parvovirus; Complete genome;Cloning; Sequence analysis

河南省重大科技專項(111100110300)。

陳龍彪(1989- )，男，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：分子病原學。*通訊作者。

2014-12-17

S 852.65+1

A

0517-6611(2015)04-026-04