白文靜，吳新欣，劉 謙，劉麗麗，周 楊，方孟影

(河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保定分中心，河北保定 071051)

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HPLC法測定乳制品中的黃曲霉毒素M1

白文靜，吳新欣，劉 謙*，劉麗麗，周 楊，方孟影

(河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心保定分中心，河北保定 071051)

[目的]建立高效液相色譜法測定乳制品中黃曲霉毒素M1的測定方法。[方法]供試乳制品經提取、凈化后用高效液相色譜法測定其中黃曲霉素M1的含量。[結果]黃曲霉毒素M1在2～10 ng/ml范圍內線性良好，相關系數r=0.995 9，平均回收率為96.7%，檢出限為0.4 μg/kg。[結論]研究所用方法簡單準確，穩(wěn)定性和重現性較好，可用于乳制品中黃曲霉毒素M1含量的測定。

乳制品；黃曲霉毒素M1；高效液相色譜法；含量測定

黃曲霉毒素在1993年被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)癌癥研究機構(International Agency for Research on Cancer)劃定為 Ⅰ 類致癌物(明確的人類致癌物), 是一種毒性極強的劇毒物質，其毒性是氰化鉀的10倍，主要表現為致癌、致畸、致突變[1]。黃曲霉毒素M1對熱非常穩(wěn)定，299 ℃才會被破壞，在一般烹調溫度、巴氏殺菌或者高溫殺菌條件下幾乎都不會被破壞[2]。哺乳動物在攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后，在體內的肝微粒體單氧化酶系催化下，被羥基化生成的二次毒性代謝產物為黃曲霉毒素M1[3]。黃曲霉毒素M1在進入人體或動物體后，除了抑制DNA、RNA合成外, 也會抑制肝臟蛋白質合成，導致人體中毒[4]。該毒素主要危害的部位在肝臟，其危害主要表現在損害組織器官、引發(fā)動物及人類的肝癌、腎癌和胃癌等抑制免疫機能[5]，其毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。黃曲霉毒素M1一部分從尿和乳汁中排出, 一部分存在于動物細胞的可食部分如肝、蛋類、 腎、 血和肌肉中, 其中以乳最為常見[6]。牛乳及其制品是易受黃曲霉毒素M1污染的食品之一，對牛奶中黃曲霉毒素M1準確定量(如我國規(guī)定牛奶中黃曲霉毒素M1的最大殘留限量為0.5 μg/kg[7])，了解真實污染水平，對維護人群健康具有重要意義。

HPLC 法是利用免疫親和柱或C18柱將樣品中的黃曲霉毒素M1 萃取、凈化、濃縮、分離，再通過HPLC 串聯(lián)檢測器進行檢測[8]。免疫親和柱是利用抗原抗體的特異性吸附特性, 親和柱只能特異性、選擇性地吸附黃曲霉毒素，而其他雜質則順利通過柱子, 然后再利用洗脫液將黃曲霉毒素洗脫下來[9]。該方法大大簡化了樣品的前處理過程, 且利用高效液相色譜法可同時進行定量和定性黃曲霉毒素M1,具有操作簡單、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，得到廣泛的應用[10]。

1 材料與方法

1.1 材料供檢測樣品為某品牌幼兒奶粉。島津LC-20AT高效液相色譜儀，附帶RF-20A熒光檢測器；KQ-500超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；離心機，轉速7 000 r/min；氮吹儀；黃曲霉毒素M1免疫親和柱，北京泰樂祺科技有限公司；黃曲霉毒素M1標準溶液，純度≥98%。

1.2 方法

1.2.1色譜條件。色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈+水(25+75)；流速：1.0 ml/min；柱溫：40 ℃；熒光檢測器：365 nm激發(fā)波長、435 nm發(fā)射波長；進樣體積：10 μl。

1.2.2線性關系。將標準品溶液儲備液(濃度：0.5 μg/ml)用10%乙腈適當稀釋后制得濃度分別為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的標準品溶液，進樣分析，結果表明，黃曲霉毒素M1在2～10 ng/ml濃度范圍內線性關系良好。線性方程如下：Y=aX+b(a=2.422 222e-003，b=0.710 529 5)，R2=0.991 847 5，R=0.995 915 4。

1.2.3試樣前處理。稱取混合均勻的奶粉平行樣10 g置于250 ml燒杯中，將50 ml已預熱到50 ℃的水多次少量加入到乳粉中，攪拌使其溶解，冷卻后置于100 ml容量瓶中，多次少量水淋洗轉移，定容至刻度，濾紙過濾或4 000 r/min離心15 min，至少收集50 ml乳試樣，備用。

將免疫親和柱連接在50 ml玻璃注射器下，準確量乳試樣50 ml加入玻璃注射器，與真空泵相連,控制試樣以2～3 ml/min穩(wěn)定的流速過柱。注入10 ml純水分淋洗免疫親和柱。棄去全部流出液，抽干親和柱。加入4.0 ml色譜級乙腈洗脫，收集全部洗脫液于玻璃試管中，然后30 ℃氮吹至近干，用水定容至1 ml,供LC測定。

2 結果與分析

2.1 工作曲線配制濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ng/ml的黃曲霉毒素M1標準工作液進行分析，標準曲線如圖1所示。

2.2 檢出限將標準品溶液儲備液適當稀釋后制得一系列不同濃度的標準品溶液，進樣分析，以信噪比3∶1作為檢出限，得出黃曲霉毒素M1的檢出限為0.4 μg/kg。

2.3 精密度試驗取標準品溶液，連續(xù)進樣6次，結果表明，黃曲霉毒素M1的RSD為2.60%，精密度良好。

2.4 重復性試驗取試樣(以乳粉為例)，每試樣6份平行樣，分別照供試品溶液制備項下方法操作，結果表明，黃曲霉毒素M1的RSD為6.0%，重復性良好。

2.5 回收率試驗取黃曲霉毒素M1陰性的乳粉10 g，加入濃度為0.5 μg/ml的黃曲霉毒素標準溶液0.04 ml，照供試品溶液制備項下方法依法操作，測定，檢測結果見表1。

表1 黃曲霉毒素M1加標回收試驗(n=6)

2.6 標準物質測定機國際實驗室能力測試結果取黃曲霉毒素M1陽性的奶粉標準物質5 g(真值為0.6 μg/kg)，每試樣3份平行樣，分別按供試品溶液制備方法操作，測得結果均在允許范圍內，與真值相接近。采用此方法參加由遼寧局實驗室測量審核，以奶粉為測試樣品,結果令人滿意。

3 討論

該試驗建立了高效液相色譜法測定乳制品中的黃曲霉毒素M1的方法。此方法基于免疫親和柱對黃曲霉毒素吸附的專一性,利用HPLC的良好分離效果,達到了靈敏、準確的檢測效果；同時，此方法簡單易行，檢測結果穩(wěn)定性和重現性均較好，適合于大批量樣品的檢測。

[1] 周貽兵，林野，李磊，等.高效液相色譜法測定牛奶中黃曲霉毒素M1的含量[J].食品研究與開發(fā)，2014，35(15)：96-98.

[2] 梁江，宋筱瑜，李鳳琴.黃曲霉毒素M1研究進展[J].衛(wèi)生研究，2013，42(6)：1055-1059.

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HPLC Determination of Aflatoxin M1 in Dairy Products

BAI Wen-jing, WU Xin-xin, LIU Qian*et al

(Baoding Branch of Inspection and Quarantine Technical Center, Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Baoding, Hebei 071051)

[Objective] A method using high performance liquid chromatography for the determination of Aflatoxin M1 in dairy products was presented. [Method] Sample was determined the content by HPLC after extraction and purification. [Result] Aflatoxin M1 had good linear within the scope of 2-10 ng/ml and the correlation indexr=0.995 9. The limit of detection (LOD) of the method was 0.4 μg/kg. The recovery of Aflatoxin M1 was 96.7%. [Conclusion] This method was simple, accurate, and had good stability and reproducibility for the determination of Aflatoxin M1 in dairy products.

Dairy products; Aflatoxin M1; High-performance liquid chromatography; Determination

白文靜(1990-)，女，河北定州人，從事食品中添加劑、農藥殘留的檢測研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事食品、紡織品中藥物殘留、添加劑等的檢測研究。

2015-01-08

S 879.1

A

0517-6611(2015)06-270-02