任 禛， 韓 麗， 夏體淵， 陳麗娟， 楊瑞萍, 王定康

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 云南 昆明 650214； 2.云南省高校 都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心， 云南 昆明 650214； 3.昆明學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)系， 云南 昆明 650214)

?

應(yīng)用克隆文庫(kù)構(gòu)建法分析馬鈴薯塊莖形成期根系A(chǔ)MF菌群組成

任 禛1,2， 韓 麗1,2， 夏體淵1,2， 陳麗娟1,2， 楊瑞萍1, 王定康3*

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院， 云南 昆明 650214； 2.云南省高校 都市型現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程研究中心， 云南 昆明 650214； 3.昆明學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)系， 云南 昆明 650214)

為弄清馬鈴薯生產(chǎn)中叢枝菌根真菌的作用，隨機(jī)采取馬鈴薯塊莖形成期的根系樣品，以DNA提取產(chǎn)物為基礎(chǔ)，Nested-PCR擴(kuò)增目的片段，利用該產(chǎn)物構(gòu)建AMF部分18S rRNA基因克隆文庫(kù)，運(yùn)用ARDRA篩選、DNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹等方法分析叢枝菌根真菌的結(jié)構(gòu)組成。結(jié)果表明：文庫(kù)Coverage C值為89.7%，但Rarefaction曲線不夠飽和；獲得的8個(gè)AMF類型均與免培養(yǎng)的球囊霉屬克隆序列相似度較高，其中Seq2、Seq3、Seq5和Seq8代表的摩西球囊霉(Glomusmosseae)、幼套球囊霉(Glomusetunicatum)、近明球囊霉(Glomusclaroideum)和地表球囊霉(Glomusversifome)分類地位較為清晰，其余序列可能代表的球囊霉屬較新種類。

叢枝菌根真菌； 馬鈴薯； 18S rRNA基因； 克隆文庫(kù)； 系統(tǒng)發(fā)育樹

叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一類廣泛存在于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的異養(yǎng)微生物，能夠侵染大多數(shù)植物根系并形成菌根結(jié)構(gòu)，這種共生體的建立對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[1]。關(guān)于AMF在植物上的應(yīng)用已有較多報(bào)道，大量試驗(yàn)證實(shí)[2-4]，AM真菌侵入植物根系后，能夠改變根系構(gòu)型，提高光合作用，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用，并能提高植株對(duì)病原菌、重金屬、高鹽和弱光等不良脅迫的耐受性，從而改善品質(zhì)提高產(chǎn)量。同時(shí)，AMF在修復(fù)污染土壤，提高幼苗移栽成活率方面也具有積極作用[5-6]。叢枝菌根真菌在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起重要作用[7]。因此，AMF是一類寶貴的微生物資源，在植物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究中其功能作用不可忽略。了解某種植物根圍AMF組成和結(jié)構(gòu)是研究其功能作用的基礎(chǔ)工作，可為篩選優(yōu)勢(shì)或功能型的AMF類型提供參考。

叢枝菌根真菌需與植物共生后才能完成生活史，因此難以進(jìn)行分離培養(yǎng)，這為其多樣性研究帶來(lái)一定困難。而傳統(tǒng)上依賴于形態(tài)學(xué)觀察和特定物質(zhì)測(cè)定的方法已無(wú)法滿足AMF研究的需要。近年來(lái)，以真菌微生物核糖體基因分析為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)AMF特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，結(jié)合DGGE、AFLP、DNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析等分子生物學(xué)方法，為植物根際或根系A(chǔ)MF組成結(jié)構(gòu)的研究提供了新思路和新技術(shù)。在多種方法中，AMF部分18S rRNA基因克隆文庫(kù)構(gòu)建是準(zhǔn)確揭示其多樣性和組成結(jié)構(gòu)的重要方法之一，已被廣泛應(yīng)用到洋蔥、夏枯草、旱生植物、荻草、滿天星和玉米等植物上[8-12]。目前國(guó)外對(duì)此方面的報(bào)道較多，而國(guó)內(nèi)較少。特定片段克隆文庫(kù)的構(gòu)建為探索植物根圍AMF的多樣性提供了幫助。

關(guān)于AMF在馬鈴薯生產(chǎn)上應(yīng)用的報(bào)道較少，但不同菌根菌劑對(duì)其不同時(shí)期營(yíng)養(yǎng)元素的促進(jìn)作用已被證實(shí)[13]，并且不同菌劑對(duì)植株生物量的提高作用亦被揭示[14]。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，AMF與植物共生關(guān)系的建立具有復(fù)雜性，在綜合因素的影響下，馬鈴薯根系可能存在多種AMF類型，準(zhǔn)確探索其組成可為揭示AMF功能作用奠定基礎(chǔ)。馬鈴薯塊莖形成期是植物整個(gè)生長(zhǎng)周期的關(guān)鍵時(shí)期，直接決定最終產(chǎn)量，探明此時(shí)期植株根系的AMF組成具有實(shí)際意義。筆者通過構(gòu)建馬鈴薯塊莖形成期根系A(chǔ)MF部分18S rRNA基因克隆文庫(kù)，了解此生長(zhǎng)階段根系優(yōu)勢(shì)和AMF組成，初步揭示對(duì)馬鈴薯產(chǎn)量具有重要作用的AMF類型，也為多種菌劑在實(shí)際生產(chǎn)中的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯品種為合作88號(hào)，在富源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

于2013年4月在昆明學(xué)院觀物山上播種馬鈴薯，常規(guī)水肥管理，植株生長(zhǎng)至60 d時(shí)(塊莖形成期)隨機(jī)選取3株采集根系。取樣時(shí)將植株連根拔起，剪除地上部，抖掉附著土壤，用自來(lái)水清洗泥土，紗布擦拭根系水分后剪成0.1 cm的根段備用。

1.3 DNA提取

將3株植物根系充分混勻，隨機(jī)稱取2 g用于DNA提取，參照任禛等[11]方法，DNA產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。

1.4 巢式PCR擴(kuò)增

DNA經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，第1次和第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系一致，反應(yīng)條件不同，具體引物見表1[12]。第一次采用真菌18S rRNA基因通用引物GeoA2和Geo11，產(chǎn)物長(zhǎng)度1.8 kb，反應(yīng)體系參照常規(guī)，保證模板DNA量為0.2～1 μg。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為菌根真菌特異混合引物(AM1，AM2，AM3)和NS31，產(chǎn)物長(zhǎng)度550 bp。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，65℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后用于后續(xù)克隆文庫(kù)構(gòu)建。

表1 馬鈴薯根系的巢式PCR引物

1.5 克隆文庫(kù)構(gòu)建、陽(yáng)性克隆子確定與酶切篩選

采用Takara pMD 18-T Vector克隆試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞JM109，轉(zhuǎn)化后產(chǎn)物涂布于含青霉素、X-Gal和IPTG的平板中隔夜培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)到合適大小，隨機(jī)挑選35個(gè)白色克隆子在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌體抽提質(zhì)粒，PCR排除假陽(yáng)性克隆子，最終確定30個(gè)陽(yáng)性克隆子。分別用HinfⅠ和TaqⅠ進(jìn)行酶切篩選，2個(gè)酶切圖譜一致的克隆子歸為1個(gè)OTU，每個(gè)OTU選擇代表性克隆子測(cè)序。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序中對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行相似性搜索，尋找相似度較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行完全對(duì)比，并用Mega 3.0軟件分析，采用鄰位相鄰法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)及多樣性計(jì)算

采用庫(kù)容值計(jì)算以及稀有飽和度曲線繪制評(píng)價(jià)文庫(kù)大小。庫(kù)容值Coverage C計(jì)算公式為C=[1-(n/N)]×100，其中n代表僅有單個(gè)克隆子的OTU數(shù)，N為總克隆數(shù)目[15]。稀有飽和度曲線Rarefaction Curve采用Analytic Rarefaction Version 1.3軟件繪制[16]。運(yùn)用SPADE軟件計(jì)算文庫(kù)Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯根DNA提取和PCR擴(kuò)增

由圖1可見，提取DNA產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后在21 kb處獲得明亮單一條帶，說(shuō)明提取的純度和濃度較為理想，滿足試驗(yàn)要求。以DNA為模板經(jīng)第1次PCR擴(kuò)增后，在1.8 kb處獲得目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。上述PCR產(chǎn)物可直接用于2次擴(kuò)增，成功獲得0.5 kb目的產(chǎn)物，且電泳檢測(cè)結(jié)果單一明亮。終產(chǎn)物連接到pMD 18-T載體中，轉(zhuǎn)入JM109構(gòu)建馬鈴薯根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)。

注：M1為λ-HindⅢ digest DNA Marker，M2為DL2000 Marker，泳道1為DNA提取結(jié)果，泳道2為第1次PCR結(jié)果，泳道3為第2次PCR結(jié)果。

Note：M1：λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker，M2：DL2000 Marker；Lane 1：The results of DNA extraction；Lane 2：The results of first Nested-PCR；Lane 3：The results of second Nested-PCR.

圖1 馬鈴薯DNA提取與巢式PCR圖譜

Fig.1 The results of DNA extraction and Nested-PCR

圖2 AMF克隆文庫(kù)的稀有飽和度曲線

2.2 陽(yáng)性克隆子鑒定及ARDRA結(jié)果

經(jīng)酶切分析共獲得9種差異圖譜，每種圖譜選擇代表克隆子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有1個(gè)序列(對(duì)應(yīng)1個(gè)克隆子)為馬鈴薯未知基因序列，其余8個(gè)序列(對(duì)應(yīng)29個(gè)克隆子)均為AMF 18S rRNA基因序列。

2.3 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)及多樣性指數(shù)

通過計(jì)算，馬鈴薯根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)的Coverage C值為89.7%。Rarefaction曲線結(jié)果表明(圖2)，文庫(kù)中的OTU數(shù)目隨著克隆數(shù)目的增加仍呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明文庫(kù)大小對(duì)馬鈴薯根系A(chǔ)MF類群組成雖有一定反映，但仍不夠飽和，需加大克隆子數(shù)目，增加文庫(kù)包含的AMF類型。經(jīng)SPADE計(jì)算，文庫(kù)的Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)分別為1.91和0.19。

2.4 AMF序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

經(jīng)BLAST分析，在GenBank中，代表不同OTU類型的8個(gè)差異序列均與免培養(yǎng)的克隆序列相似度最高(表2)。篩選親緣關(guān)系最近的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，8個(gè)目的序列被劃分為2大類群，序列Seq2、Seq4、Seq5、Seq6和Seq7聚集在一大分支上，而Seq1、Seq3和Seq8序列聚集在一個(gè)小分支上。從序列代表類型來(lái)看，全部序列均為球囊霉屬的種類，其中Seq2、Seq3、Seq5和Seq8的分類地位較為清晰，而其余序列均與球囊霉屬未知序列關(guān)系較近，可能代表該屬較為新穎的類型。

具體分析系統(tǒng)發(fā)育樹，Seq2與摩西球囊霉(Glomusmosseae) BEG12聚集在一起，兩者的同源性高達(dá)99%以上，可見Seq2代表該種類型；Seq3與2個(gè)幼套球囊霉(Glomusetunicatum)序列聚集在一小分支上，且相似性較高，同源性達(dá)99%以上，說(shuō)明Seq3應(yīng)為幼套球囊霉；雖然Seq5與GenBank中的未知球囊霉屬的克隆子相似性較高，但在系統(tǒng)進(jìn)化樹中與近明球囊霉(Glomusclaroideum)免培養(yǎng)克隆子的相似度亦較高，Seq5應(yīng)為近明球囊霉；Seq8分類地位非常清晰，單獨(dú)與2個(gè)地表球囊霉(Glomusversiforme)克隆子聚集在一起，且與地表球囊霉克隆2相似性最高，接近100%，因此該序列代表的是地表球囊霉；Seq1、Seq4、Seq6和Seq7均與球囊霉屬克隆子關(guān)系最近，但準(zhǔn)確分類地位不清楚。

從8個(gè)序列對(duì)應(yīng)的克隆子數(shù)目來(lái)看，Seq1和Seq2應(yīng)為文庫(kù)中的主要類群，應(yīng)是侵襲馬鈴薯根系的主要AMF種類，Seq3和Seq8代表著文庫(kù)中較為常見的類型，而Seq4、Seq5、Seq6和Seq7代表的克隆子較少為1～2個(gè)，為馬鈴薯根系中鮮少的AMF類型。

表2 AMF克隆文庫(kù)序列的相似菌種

圖3 AMF部分18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogenetic tree of AMF partial 18S rRNA gene

3 結(jié)論與討論

AMF在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的作用已被廣泛證實(shí)，調(diào)查農(nóng)作物根系A(chǔ)MF的組成和結(jié)構(gòu)是研究其具體功能作用的基礎(chǔ)工作。傳統(tǒng)上，一般主要通過植物根部染色再進(jìn)行顯微形態(tài)觀察辨別AMF種類，但AMF微生物種屬之間并無(wú)明顯的結(jié)構(gòu)差異，只能初步判斷AMF類群組成，難以鑒定到具體種類，且無(wú)從準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)某種AMF的數(shù)量[17]。近年來(lái)，利用分子生物學(xué)技術(shù)，以根系DNA提取為基礎(chǔ)，通過AMF特異引物擴(kuò)增目的片段，借助DGGE、AFLP和克隆文庫(kù)構(gòu)建等方法分離差異AMF類型，再結(jié)合測(cè)序技術(shù)，可直觀的從分子水平上識(shí)別AMF種類[11,18-19]。相比之下，分子技術(shù)具有高效、客觀和可重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)。在幾種分子生物學(xué)方法中，克隆文庫(kù)構(gòu)建法能夠克服DGGE條帶分離不明顯、研究基因太短的局限，又能克服AFLP靈敏度不高、結(jié)果不清晰的缺點(diǎn)，是研究AMF多樣性的理想方法。

馬鈴薯根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)中共檢測(cè)到8個(gè)差異序列，除Seq2、Seq3、Seq5和Seq8代表的摩西球囊霉、幼套球囊霉、近明球囊霉和地表球囊霉外，其余序列都與AMF未知克隆子序列的相似度較高，可能代表的是較為新穎的類型，在玉米[11]上亦發(fā)現(xiàn)了多種分類地位不清晰的AMF種類。國(guó)外有研究采用克隆文庫(kù)構(gòu)建法在森林植物、旱生植物、夏枯草和荻草等植物上均發(fā)現(xiàn)了未知的AMF類型[10,12,20]。筆者認(rèn)為，生態(tài)系統(tǒng)中的AM微生物的多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人類的認(rèn)知，生態(tài)系統(tǒng)的多元化和植物的多樣性決定了AMF種類的復(fù)雜性。傳統(tǒng)上的方法只認(rèn)知小部分種類，要深入挖掘利用此類微生物資源，應(yīng)對(duì)多種農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)土壤和不同作物菌根進(jìn)行研究，建立AMF資源庫(kù)，并研究相應(yīng)功能，為其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，8個(gè)序列全部為球囊霉屬的特異序列，其中摩西球囊霉是馬鈴薯塊莖形成期根系的主要類型，幼套球囊霉和地表球囊霉是常見種類，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較為一致。王玉峰等[13]和張功等[14]均研究不同AMF對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響發(fā)現(xiàn)，摩西球囊霉對(duì)馬鈴薯生物量和產(chǎn)量的促進(jìn)作用最為明顯，并且對(duì)其土壤的速效氮、磷和鉀的改善作用亦優(yōu)于其他AMF種類。筆者同樣發(fā)現(xiàn)，摩西球囊霉是玉米根系的主要種類[11]。有綜述表明[21]，我國(guó)糧食作物根際土壤AMF類型以摩西球囊霉為主，而幼套球囊霉和地表球囊霉是較為常見的種類。國(guó)內(nèi)外通過克隆文庫(kù)構(gòu)建法對(duì)玉米、大豆、洋蔥和滿天星等根系的研究表明，球囊霉屬的AMF是侵染植物根系的主要類群，以摩西球囊霉最為普遍[8-9,11]。可見，摩西球囊霉普遍能與多種植物建立共生關(guān)系，是AMF的重要種類，其對(duì)植物的功能作用值得研究。

馬鈴薯塊莖形成期是決定產(chǎn)量和質(zhì)量的重要時(shí)期，此時(shí)植株對(duì)水分和營(yíng)養(yǎng)元素的吸收水平直接影響塊莖數(shù)量和大小，而此時(shí)叢枝菌根真菌的生態(tài)功能作用不可忽略。有研究證實(shí)AMF對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)和產(chǎn)量的積極作用[13-14]，結(jié)合本研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)的8種AMF類型，尤其是摩西球囊霉，一般在苗期能侵染馬鈴薯植株，生長(zhǎng)至塊莖形成期這種共生關(guān)系趨于穩(wěn)定，此時(shí)AM微生物大量的菌絲伸出根外，擴(kuò)大了植物根系吸收面積，并能活化土壤中難溶解的磷元素，幫助植株吸收各種營(yíng)養(yǎng)元素，最終對(duì)馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生積極影響。本文僅探討了馬鈴薯塊莖形成期根系的AMF組成，但不同的AMF種類間的關(guān)系是亟待研究的問題。

[1] Smith S E,Read D J.Mycorrhizal Symbiosis(2nd Ed.)[M]．London：Academic Press，1997:4-160．

[2] 呂桂云,陳桂林.蔬菜作物VA菌根研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,24(1):99-103.

[3] 仝瑞建,劉雪琴,耿惠敏.叢枝菌根真菌對(duì)洛陽(yáng)紅牡丹苗期生長(zhǎng)及礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的影響[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(10):104-106.

[4] 蔡柏巖,葛菁萍,接偉光,等.黃檗根圍叢枝菌根真菌菌群組成[J].菌物學(xué)報(bào),2009,28(4):512-520.

[5] Gosling P,Hodge A,Goodlass G, et al.Arbuscular mycorrhizal fungi and organic farming[J].Agriculture Ecosystems and Environment,2006,113:17-35．

[6] Postma W M,Olsson P A,Ursula F G. Root colonisation by arbuscular mycorrhizal, fine endophytic and dark septate fungi across a pH gradient in acid beech forests[J].Soil Biology & Biochemistry,2007,39:400-408.

[7] Requena N,Serrano E,Oc n A,et al.Plant signals and fungal perception during arbuscular mycorrhizal establishment[J].Phytochemistry,2007,68:33-40.

[8] Juan C S,Roger D F,Anders T.Seasonal dynamics of arbuscular fungi communities in roots in a seminatural grassland[J].Applied and Environment Microbiology,2007,73(17):5613-5623.

[9] Guillermo A,Galvan I P,Karin B.Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in onion roots from organic and conventional farming systems in the Netherlands[J].Mycorrhiza,2009,19:317-328.

[10] Armelle G,Diederik V T,David A.Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising roots of the grass species Agrostis capillaries and Lolium perenne in a field experiment[J].Mycorrhiza,2004,14:111-117.

[11] 任 禛,王建武,馮遠(yuǎn)嬌,等.應(yīng)用克隆文庫(kù)研究玉米根系A(chǔ)MF多樣性方法的建立[J].玉米科學(xué),2011,9(5):19-24．

[12] Alguacil M M,Roldan A,Torres M P,et al.Assessing the diversity of AM fungi in arid gypsophilous plant communities[J].Environmental Microbiology,2009,11(10):2649-2659．

[13] 王玉峰,孫 磊,李偉群,等.VA菌根真菌對(duì)馬鈴薯養(yǎng)分吸收的影響[J].北方園藝,2007,6:47-49．

[14] 張 功,旺 慶,崢 嶸,等.不同VA菌根真菌對(duì)馬鈴薯生長(zhǎng)的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2001,16(4):115-118．

[15] Moyer C L,Tiedje J M,Dobbs F C. A computer-simulated restriction fragment length polymorphism analysis of bacterial small-subunit rRNA genes：efficacy of selected tetrameric restriction enzymes for studies of microbial diversity in nature[J].Applied and Environment Microbiology,1996,62(7):2501-2507．

[16] Ravenschlag K, Sahm K,Pernthaler J.High bacterial diversity in permanently cold marine sediments[J].Applied and Environment Microbiology,1999,65(9):3892-3989．

[17] Hart M M,Reader R J.Taxonomic basis for variation in colonization strategies of arbuscular mycorrhizal fungi[J].New Phytologist,2002,153(2):335-344．

[18] 龍良鯤,羊宋貞,姚 青,等.AM真菌DNA提取與PCR-DGGE分析[J].菌物學(xué)報(bào),2005,24(4):564-569．

[19] 蔡邦平,陳俊愉,張啟翔,等．梅根系叢枝菌根真菌AFLP分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,34(1):82-87．

[20] Vincent C,David R,Alain O,et al.Molecular analysis of arbuscular mycorrhizal community structure and spores distribution in tree-based intercropping and forest systems[J].Agriculture，Ecosystems and Environment,2009,131:32-39．

[21] 李桂貞,張德罡,楊富裕.糧食作物AM真菌研究進(jìn)展[J].土壤肥料科學(xué),2008,24(2):250-254．

(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Analysis on AMF Community Composition of Potato Roots at Tuber Formation Stage by Applying Clone Library Construction Method

REN Zhen1,2, HAN Li1,2, XIA Tiyuan1,2, CHEN Lijuan1,2, YANG Ruiping1， WANG Dingkang3*

(1.SchoolofAgriculture，KunmingCollege，Kunming,Yunnan650214； 2.UrbanModernAgriculturalEngineeringResearchCenter,CollegesandUniversitiesinYunnanProvice，Kunming,Yunnan650214; 3.LifeScienceandTechnologyDepartmant,Kunmingcollege,Kunming,Yunan650214,China)

In order to provide a reference for AMF applying in potato production, the roots of potato at the tuber formation stage were randomly sampled in this study. Based on the DNA extraction production, the purpose fragments were obtained by Nested-PCR. These DNA fragments were used to construct AMF partial 18S rRNA gene clone library. AMF community composition of potato roots were studied combining with ARDRA screening, DNA sequencing and phylogenetic tree analysis. These results show that the Coverage C value of library is 89.7%, but the rarefaction curve is not saturated enough. Eight AMF types show high similarity with unculturedGlomussequences. The taxonomic status of Seq2, Seq3, Seq5 and Seq8 are clear. These four sequences representGlomusmosseae,Glomusetunicatum,GlomusclaroideumandGlomusversifomerespectively. The remaining sequences may represent novelGlomusspecies.

AMF；potato; 18S rRNA gene；clone library；phylogenetic tree

2014-09-13； 2015-03-14修回

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究自籌基金“Bt基因?qū)雽?duì)玉米與AMF共生關(guān)系及其誘導(dǎo)青枯病抗性的研究”(2013FZ099)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)基金“克隆文庫(kù)構(gòu)建法研究Bt棉對(duì)根系A(chǔ)MF多樣性的影響”(YJL12002);昆明學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目“緩解馬鈴薯水分脅迫壓力的叢枝菌根篩選研究”(XJL14018)；云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項(xiàng)目

任 禛(1983-)，女，講師，博士，從事農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail:10067994@qq.com

*通訊作者:王定康(1966-),男，教授，從事植物生態(tài)學(xué)的教學(xué)與科研工作。E-mail:wdk117@163.com

1001-3601(2015)05-0229-0028-05

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