李 雪， 黃志強(qiáng)， 姜 君， 陳慶富

(貴州師范大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

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不同蕎麥品種落粒基因的篩選

李 雪， 黃志強(qiáng)， 姜 君， 陳慶富*

(貴州師范大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

為獲得蕎麥落粒性相關(guān)基因，分別選取甜蕎、苦蕎和金蕎的不同品種不同組織混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)、功能分析與功能注釋獲取與落粒性相關(guān)的Unigene。設(shè)計(jì)引物通過(guò)RACE方法擴(kuò)增候選基因，測(cè)序后將候選基因全長(zhǎng)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)blast尋找候選基因的命名，用實(shí)時(shí)定量熒光PCR測(cè)候選基因的表達(dá)量。結(jié)果表明：得到6個(gè)候選基因，其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因、NPR5-like蛋白基因主要在花器官的發(fā)育和形成過(guò)程中起調(diào)控作用，而SRG1-like蛋白基因、過(guò)氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物離區(qū)的形成和發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用。NPR5-like蛋白基因在落粒品種與不落粒品種間的表達(dá)量差異最大。結(jié)論：NPR5-like蛋白基因在蕎麥落粒過(guò)程中起一定的調(diào)控作用。

蕎麥； 落粒性； 轉(zhuǎn)錄組； 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

蕎麥屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)[1]。有甜蕎(F.esculentumMoench)和苦蕎(F.tataricum(L.)Gaertn)2個(gè)栽培種[2]，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的維生素和大量的黃酮類化合物[3-4]，能有效控制和治療多種疾病，增強(qiáng)身體的免疫力及預(yù)防癌癥，食用藥用價(jià)值高[5-7]。但在蕎麥的栽培過(guò)程中，落?，F(xiàn)象非常嚴(yán)重。落?，F(xiàn)象在豆科、禾本科、十字花科以及胡麻科等植物中廣泛存在，是植物在長(zhǎng)期生存競(jìng)爭(zhēng)及進(jìn)化過(guò)程中為抵御惡劣外界環(huán)境及繁衍后代逐漸形成的一種適應(yīng)機(jī)制[8-9]。落粒對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，大量種子在收獲前自然脫落，不僅增加采收難度，提高生產(chǎn)成本，而且使種子質(zhì)量和產(chǎn)量均受到嚴(yán)重影響。因此，通過(guò)減少落粒現(xiàn)象提高蕎麥的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)于蕎麥生產(chǎn)和栽培具有重大意義。

近年來(lái)，研究者對(duì)不同植物的落粒現(xiàn)象進(jìn)行了大量研究，早期主要側(cè)重于生理生化方面，通過(guò)長(zhǎng)期的馴化實(shí)踐不斷地對(duì)作物器官脫落特性加以選擇，解決禾本科作物落粒、斷穗，豆類作物提前開(kāi)莢等問(wèn)題，減少了產(chǎn)量損失。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，解析離區(qū)發(fā)育和落粒現(xiàn)象的分子機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，植物激素尤其是乙烯、ABA以及生長(zhǎng)素之間的相互作用在植物落粒性中起著重要作用[11-14]。此外，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了1對(duì)控制花器官離區(qū)發(fā)育的功能重復(fù)基因BOP1和BOP2[15]，以及MADS-box基因AGL15和AGL18，其過(guò)表達(dá)可以延遲花器官的脫落[16-17]。Li等[18]通過(guò)QTL定位法研究水稻的落粒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，SH4基因可控制離區(qū)的發(fā)育。但蕎麥的落粒性相關(guān)基因篩選前人尚未有研究，為進(jìn)行蕎麥落粒相關(guān)基因篩選，在無(wú)參考基因組的情況下，筆者對(duì)不同蕎麥品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以及功能基因的分析獲得蕎麥落粒性相關(guān)的候選基因，然后利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR獲得候選基因在不同蕎麥品種上的相對(duì)表達(dá)量差異，旨在探索蕎麥不同品種中與落粒性相關(guān)的基因，為降低蕎麥落粒性和提高其產(chǎn)量、品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料

由于落粒性與葉柄處的離區(qū)相關(guān)，故取葉組織和灌漿期的花序組織作為測(cè)序樣本。于2013年5月在貴陽(yáng)市永樂(lè)鄉(xiāng)貴州師范大學(xué)柏楊實(shí)驗(yàn)基地分別取甜蕎、苦蕎和金蕎不同品種的葉組織和花序組織，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表1)。

1.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR的材料

由于自然界中的金蕎均為落粒品種，而甜蕎和苦蕎均有落粒品種和不落粒品種，故于2014年10月在貴陽(yáng)市永樂(lè)鄉(xiāng)貴州師范大學(xué)柏楊實(shí)驗(yàn)基地分別取甜蕎、苦蕎和金蕎不同品種的花序，置于EP管中，-80℃冰箱保存(表2)。以金蕎作為落粒性品種的對(duì)照，與甜蕎和苦蕎的不同品種進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR。

表2 用于實(shí)時(shí)定量熒光PCR的材料情況

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與Unigene的篩選

提取用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣本總RNA，用OligoT探針引物分離帶有PolyA的mRNA，純化后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。構(gòu)建不同大小片段的cDNA文庫(kù)，進(jìn)行基因組測(cè)序。把獲取的各樣品Reads采用Trinity軟件[19]進(jìn)行組裝，獲得序列重疊群，將重疊群組成轉(zhuǎn)錄本，再將各樣品組裝結(jié)果中多個(gè)可變剪接的轉(zhuǎn)錄本聚類到1個(gè)基因，最后得到對(duì)應(yīng)物種的1個(gè)Unigene庫(kù)。利用篩選得到的Unigene序列信息，預(yù)測(cè)得到對(duì)應(yīng)Unigene的編碼序列和蛋白序列。使用IDE6 software對(duì)差異基因進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行FDR校正，得到差異基因。對(duì)篩選出的差異表達(dá)的基因作表達(dá)模式聚類分析，將具有相同或相似表達(dá)行為的基因聚類。通過(guò)Unigene核酸序列與數(shù)據(jù)庫(kù)的blast比對(duì)，提取得到差異表達(dá)基因Nr，Nt，GO，COG，kegg，swissprot，trembl等庫(kù)的注釋，根據(jù)注釋結(jié)果選出與蕎麥落粒相關(guān)的Unigene。

1.4 RACE方法擴(kuò)增基因全長(zhǎng)序列

改良Trizol法[20]提取各蕎麥樣品總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，-80℃保存。以各蕎麥樣品總RNA為模板，使用M-MLV Reverse Transcriptase(Takara, Japan)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，簡(jiǎn)并引物，通過(guò)降落式PCR反應(yīng)克隆得到各候選基因保守區(qū)片段。分別設(shè)計(jì)上游外側(cè)和內(nèi)側(cè)特異性引物GSP1和GSP2以及下游外側(cè)和內(nèi)側(cè)特異性引物GSP1和GGSP2(表3)，利用3′-RACE外側(cè)引物(5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′)、3′-RACE內(nèi)側(cè)引物(5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′)、5′-RACE外側(cè)引物(5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′)和5′-RACE內(nèi)側(cè)引物(5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′)，通過(guò)3′-FullRACE Core Set with PrimeScript RTase試劑盒和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒進(jìn)行3′-RAEC和5′-RACE擴(kuò)增。將保守區(qū)片段、3′-RAEC和5′-RACE片段拼接后獲得各候選基因的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)特異引物(表4)進(jìn)行擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Axygen，USA)切膠回收，純化后連接到pMD18-T-simple載體(Takara,Japan)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆后，測(cè)序鑒定。

表3 候選基因上游和下游的內(nèi)外側(cè)特異性引物序列

Table 3 The sequence of inside and outside specific primers of upstream and downstream regions of candidate genes

候選基因編號(hào)No.ofcandidategenes引物序列5'—3'Primerssequences1上游 GSP1CACACGGACTTCGCACAACC GSP2AAGAAGTTTACACTATTGGGTCCTG下游 GSP1GTGTAAACTTCTTGGGGAGCTTC GSP2GAATGTCATTAGAGCTTGGGTTG2上游 GSP1AATTACATCTGAAGCTTCTCGGG GSP2CCTGCCCACTCTAGCTTTCTG下游 GSP1TGTATCTTAGCATTTCCAGAAGGAG GSP2TGTATGTGAGCGCAGGTGAAG3上游 GSP1CCAAGACATTAGGAAAGCTGAATC GSP2GATCAGGCGGTGGTTCAAAG下游 GSP1AACGCTGTCCAGGTCGAAGAG GSP2TCTCCTTCTCCACGAATCCTG4上游 GSP1AAGTGTTATGAGTGGAAGAAGATTGC GSP2TCTACTTGAGTATTGGTATCCCGG下游 GSP1GCCTGATCGACAAACCAACG GSP2TTCTGCGGTTCTCATCGTCC5上游 GSP1AATTCTGCATGTGCTTCCTGG GSP2TCTTTAGGGTGATGCTGACAGG下游 GSP1TACGCCACAATCTTATCCATCG GSP2AAACGGATATGTCGATGTCAGC6上游 GSP1GGGTATACTTTTGTATTGGCGGA GSP2GGGGTTTATGTATTTATCGTGTCC下游 GSP1GAGGAGGTCATGGAAGAACGAG GSP2GGATCGGAGGCTGAGGAGAC

表4 候選基因的擴(kuò)增特異引物

Table 4 Specific primers for amplification of candidate genes

候選基因編號(hào)No.ofcandidategenes引物序列5'-3'Primerssequences1上游 ATGTATTGTTAAGTCCTACCAAGCG下游 CTTCCATGGGAGGTGAGGATG2上游 AAGAGGCCGTGATTGTGTGAG下游 CGAATGAGTTTAAAGGCGTTG3上游 CGGATCCAAATGTAAGAACCG下游 GGGCGAGGTTCATGTTTCTG4上游 CACTCCACTTGGCAGCCG下游 ATCGAGAGCGAGATCAACGG5上游 AAAGATATGGGAGTATTGGTGGG下游 GCCTCTCCCCCTTACATCTCC6上游 GAGTTGAACTTGTTACAGACCGTC下游 GGAGTCTTTTGTTGACGGTCTG

1.5 生物信息學(xué)分析

將得到的各候選基因cDNA全長(zhǎng)序列利用NCBI的BLAST在線軟件(http://blast.ncbi.nm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)分析其覆蓋度和功能得到各候選基因的命名和相應(yīng)的基因功能。

1.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR

設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)目的基因引物(表5)，由北京Invitrogen公司合成。利用改良Trizol法[18]提取各樣本RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，-80℃保存。采用PrimeScritTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，獲得各樣品cDNA，-20℃?zhèn)溆?。?.8SRNA為內(nèi)參基因，利用ABI7500型實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀進(jìn)行各樣本的實(shí)時(shí)定量熒光PCR試驗(yàn)：首先用SYBRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，ROX plus進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火40 s，45個(gè)循環(huán)；然后將各樣本cDNA混合后為模板進(jìn)行5倍梯度的稀釋，取稀釋后各樣品用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60～95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則篩選引物；最后將各樣品cDNA進(jìn)行10倍稀釋后作為模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增，同時(shí)在60～95℃進(jìn)行溶解曲線分析。得到各樣本試驗(yàn)結(jié)果后，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

表5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)目的基因引物

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到候選Unigene

將樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共得到14.5 Gb的可用數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與功能注釋的方法篩選得到6條與落粒相關(guān)的Unigene，功能分析與功能注釋表明，這些Unigene分別具有不同的功能(表6)，可能通過(guò)參與蕎麥不同的生理過(guò)程，調(diào)控蕎麥的落粒性。

2.2 RACE擴(kuò)增候選基因及其生物信息學(xué)分析

從表7看出，這些基因均直接或間接地參與花器官以及離區(qū)的發(fā)育。其中，根向光性蛋白基因、SOBIR1-like蛋白基因和NPR5-like蛋白基因主要在花器官的發(fā)育和形成過(guò)程中起調(diào)控作用，而SRG1-like蛋白基因、過(guò)氧化物酶基因和AGL蛋白基因主要在植物離區(qū)的形成和發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用。

表6 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中Unigene參與的生理功能

Table 6 Physiological function of Unigenes in transcriptome

Unigene序號(hào)Unigenenumber功能Unigenefunction1參與花器官的切除及花形態(tài)的發(fā)生2參與離層形成過(guò)程與器官衰老3參與頂端分生組織的發(fā)育與花粉成熟4參與分生組織的形成過(guò)程及花器官的切除5參與離層細(xì)胞壁的修飾6參與離層及細(xì)胞壁的形成

表7 候選基因的命名與功能

圖示 各基因?qū)崟r(shí)定量熒光PCR相對(duì)定量

Fig. Relative quantitative result of different genes by RT-quantitative PCR

2.3 實(shí)時(shí)定量熒光PCR與候選基因的表達(dá)量

從圖示看出，6個(gè)基因在5個(gè)品種中的相對(duì)表達(dá)量不同，其中，根向光性蛋白和AGL蛋白2個(gè)基因在紅心金蕎、野甜蕎和野苦蕎3個(gè)落粒品種中的相對(duì)表達(dá)量較高，而SRG1-like蛋白和NPR5-like蛋白2個(gè)基因在晉蕎2號(hào)和甜自21號(hào)2個(gè)不落粒品種中的相對(duì)表達(dá)量較高，而NPR5-like蛋白基因在落粒品種與不落粒品種間的表達(dá)量差異最大。

3 結(jié)論與討論

研究選取不同蕎麥品種的不同組織作為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序材料，在無(wú)蕎麥參考基因組的情況下，通過(guò)高通量測(cè)序分析與功能注釋獲得6個(gè)與蕎麥落粒性相關(guān)的Unigene。由于目前無(wú)蕎麥全基因組的測(cè)序工作，因此，無(wú)法直接通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與比對(duì)直接獲得需要的基因，故通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后在相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行功能分析與功能注釋，從中篩選出與目的功能相關(guān)的Unigene是常用方法。然后設(shè)計(jì)RACE特異引物，通過(guò)RACE擴(kuò)增的方法得到6個(gè)候選基因的全長(zhǎng)序列，并將得到的全長(zhǎng)序列提交到NCBI的blast進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)結(jié)構(gòu)與功能分析確定6個(gè)候選基因的命名。經(jīng)分析，這6個(gè)基因均參與植物重要的生物學(xué)過(guò)程，且直接或間接地參與花器官的發(fā)育或者離層的形成。然后通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR得到6個(gè)基因在不同蕎麥品種中的相對(duì)表達(dá)量差異。結(jié)果表明，6個(gè)基因中在落粒品種與不落粒品種間表達(dá)量差異最大的為NPR5-like蛋白基因，且其在甜自21號(hào)和晉蕎2號(hào)2個(gè)不落粒品種中的表達(dá)量比在金蕎、野甜蕎和野苦蕎3個(gè)落粒品種中的表達(dá)量高。說(shuō)明，NPR5-like蛋白基因在蕎麥落粒過(guò)程中起一定的調(diào)控作用。

已有研究表明，植物的落粒性與花器官的發(fā)育和離層細(xì)胞的形成和發(fā)育有關(guān)[21-22]。而本試驗(yàn)中通過(guò)熒光定量結(jié)果分析得到的NPR5-like蛋白基因與前人研究一致。NPR5被稱作BOP2，編碼細(xì)胞質(zhì)和核定位NPR1-like蛋白BOP2，能與BOP1互作。NPR6又被稱作BOP1，是蜜腺發(fā)育和正常離層區(qū)形成必需的蛋白。bop1/bop2雙突變體的葉子更持久，經(jīng)常有小葉在葉柄上。BOP2和BOP1主要參與平衡植物的生長(zhǎng)發(fā)育，與植物的落粒性有密切的關(guān)系[23]。因此，NPR5-like蛋白基因可能是通過(guò)與其蛋白家族其他相關(guān)基因相互作用，參與蕎麥的不同生理過(guò)程，從而影響花器官的發(fā)育和離層細(xì)胞的形成而參與蕎麥的落粒過(guò)程，調(diào)控著蕎麥不同品種的落粒性，但對(duì)于NPR5-like蛋白在蕎麥落粒過(guò)程中的詳細(xì)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 劉忠麗)

Screening of Seed-holding Gene in Different Buckwheat Varieties

LI Xue, HUANG Zhiqiang, JIAN Jun, CHEN Qingfu*

(GuizhouNormalUniversity,Guiyang,Guizhou550001,China)

Six candidate genes related to seed-holding character of buckwheat were determined from different tissue ofF.esculentum,F.tataricumandF.dibotrysby RT-PCR to obtain genes related to seed-holding character of buckwheat. The results showed that root phototropism protein gene, SOBIR1-like protein gene, and NPR5-like gene have the regulating effect onthe floral organ development and formation process, but SRG1-like protein gene, peroxidase gene and AGL protein gene have the regulating effect onthe development and formation process of abscission zone in buckwheat mainly. There is significant difference in expression quantity of NPR5-like gene between shattering buckwheat variety and non-shattering buckwheat variety, which indicates that NPR5-like protein gene has a certain regulating effect onseed shattering process in buckwheat.

buckwheat; seed-holding; transcriptome; real-time quantitative PCR

2014-03-14； 2015-05-04修回

國(guó)家燕麥?zhǔn)w麥現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)“蕎麥育種崗位專項(xiàng)資金”(CARS-08-A4)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“蕎麥屬植物落粒性相關(guān)基因研究”(31060207)，“蕎麥落粒性的遺傳規(guī)律及其基因序列研究”( 31171609)；貴州百十千人才計(jì)劃

李 雪(1987-)，女，在讀碩士，研究方向:從事植物遺傳、進(jìn)化與育種。E-mail:492733153@qq.com

*通訊作者：陳慶富(1966-)，男，教授，博士，從事植物遺傳、進(jìn)化與育種工作。E-mail:cqf1966@163.com

1001-3601(2015)05-0227-0019-05

S517

A