劉 娜,曲延英,陳全家,倪志勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052)

棉花HSP70基因的克隆與原核表達(dá)

劉 娜,曲延英,陳全家,倪志勇*

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830052)

以抗旱性較強(qiáng)的棉花品種‘KK1543’為材料,采用RT-PCR技術(shù)克隆了1個(gè)棉花HSP70基因,命名為GhHSP70。研究結(jié)果表明:GhHSP70基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 997 bp,編碼648個(gè)氨基酸,GhHSP70蛋白相對(duì)分子量為 70.94 kD,等電點(diǎn)為4.83。氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn),GhHSP70與歐洲大葉楊HSP70的親緣關(guān)系最近,氨基酸序列一致性達(dá)到96.4%。為進(jìn)一步分析基因的功能,構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-GhHSP70,并在大腸桿菌中異源表達(dá)。SDS-PAGE分析表明所表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致,重組蛋白在37 ℃,0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2 h時(shí)表達(dá)量最大。研究為進(jìn)一步研究棉花HSP70基因功能奠定基礎(chǔ)。

棉花;熱激蛋白70;基因克隆;原核表達(dá)

干旱是世界上危害最嚴(yán)重的一種自然災(zāi)害,是一個(gè)長(zhǎng)期存在的世界性難題。目前世界上有三分之一以上的土地處于干旱和半干旱地帶,其他地區(qū)在植物生長(zhǎng)季節(jié)也常發(fā)生不同程度的干旱[1],干旱影響植物各個(gè)階段的生長(zhǎng)發(fā)育和生理代謝過(guò)程。棉花是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重要物資,是僅次于糧食作物的第二大農(nóng)作物,其產(chǎn)值占中國(guó)經(jīng)濟(jì)作物的50%以上,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要地位[2]。干旱嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì),已成為中國(guó)棉花生產(chǎn)發(fā)展的重要限制因素。因此提高棉花的抗旱能力已經(jīng)成為現(xiàn)代棉花研究工作中急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

熱激蛋白(HSPs,heat shock proteins)是細(xì)胞受到不利環(huán)境刺激時(shí)被激活并表達(dá)增強(qiáng)的一類蛋白[3-4]。該類蛋白根據(jù)分子量的大小主要分為4類:Hsp90家族(83～90 kD)、Hsp70家族(66～78 kD)、Hsp60家族及小Hsp家族。其中HSP70是HSP家族中最重要、研究最深入的一種,是重要的分子伴侶[5-8],它能防止蛋白變性,并輔助蛋白質(zhì)重折疊為正常構(gòu)象,或者將受到不可恢復(fù)傷害的蛋白通過(guò)蛋白水解途徑排除到細(xì)胞外,從而有利于生物體抵抗脅迫壓力[9]。HSP70對(duì)植物抵抗干旱、高溫、寒冷、氧化等脅迫乃至對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育均起到十分重要的作用[10-13],是育種工作中不可多得的優(yōu)良基因。本研究前期采用蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)和生物信息學(xué)方法,對(duì)抗旱性較強(qiáng)的棉花品種‘KK1543’進(jìn)行研究,獲得了113個(gè)在干旱脅迫下差異表達(dá)的蛋白。質(zhì)譜和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)1312為棉花HSP70蛋白,這說(shuō)明棉花HSP70蛋白可能在干旱脅迫應(yīng)答中具有功能[14]。

本研究根據(jù)獲得的HSP70蛋白的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物,以棉花品種‘KK1543’為材料,克隆棉花HSP70基因,對(duì)其進(jìn)行序列分析,同時(shí)構(gòu)建了基因的原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中原核表達(dá),為進(jìn)一步研究棉花HSP70蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

棉花品種‘KK1543’由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。在實(shí)驗(yàn)室已有的60份抗旱材料中,進(jìn)行抗旱性篩選,發(fā)現(xiàn)‘KK1543’抗旱性較強(qiáng)。該品種不但具有抗旱性較好的特點(diǎn)、而且籽大,適用于水培條件下研究棉花的抗旱性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈合成 利用Plus植物總RNA提取試劑盒(天根試劑公司)提取棉花葉片總RNA。按照Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo試劑公司)說(shuō)明書(shū)操作步驟,以獲得的棉花葉片總RNA為模板,合成cDNA第一條鏈。

1.2.2GhHSP70基因的擴(kuò)增 根據(jù)前期質(zhì)譜分析獲得的棉花HSP70基因的氨基酸序列設(shè)計(jì)特異性引物GhHSP70-F(5′-AGAGTGATGGCCGGAAA-AGGAG-3′)和GhHSP70-R(5′-AGCTGTTAAACATCGGCAAAATACTATCT-3′),以棉花葉片cDNA第一鏈為模板,擴(kuò)增基因。擴(kuò)增體系:10×緩沖液(含Mg2+)5 μL,2.5 mmol/L dNTP 4 μL,10 μmol/L引物各2 μL,cDNA 1 μL,Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL,ddH2O 35.5 μL 。反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 4 min,變性94 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 1 min 30 s,35個(gè)循環(huán),再延伸72 ℃ 10 min,結(jié)束反應(yīng)。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,采用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(天根試劑公司)純化PCR產(chǎn)物,通過(guò)T-A克隆法連接到pMD19-T(Takara試劑公司),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(寶信試劑公司),涂布于含有氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后,挑取白色單菌落,經(jīng)含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h后,菌液PCR檢測(cè)是否有插入片段,將陽(yáng)性克隆送往北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 通過(guò)檢索GenBank和利用DNAMAN等軟件進(jìn)行同源性和多重序列比較分析。用 MEG 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),利用DNAStar的protean軟件預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu),利用在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析棉花熱激蛋白70基因編碼的氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.4GhHSP70基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)原核表達(dá)載體pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)引物70-28-F(5′-TTAGGATCCATGGCCGGAAAAGGAGAAG-3′)和70-28-R(5′-TAAG-CGGCCGCTTAGTCGACTTCTTCTATCTTAGG-T-3′),并以pMD19-T-GhHSP70質(zhì)粒為模板,按上述體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。利用NotⅠ和BamHⅠ(Thermo試劑公司)分別雙酶切PCR純化產(chǎn)物與空質(zhì)粒pGEX-4T-1,酶切產(chǎn)物純化后,用T4DNA連接酶22 ℃定向連接20 min,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,通過(guò)菌液PCR初步篩選陽(yáng)性重組子,陽(yáng)性克隆送上海美季測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.5GhHSP70基因的原核表達(dá) 使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金),涂布于含有氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落,經(jīng)含有氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)12 h后,通過(guò)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。

將重組菌株接種于2 mL含50 mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。然后按1∶50比例轉(zhuǎn)接到10 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg/L氨芐青霉素),225 r/min培養(yǎng)3 h(OD600≈0.6),加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L,37 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌液。以0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的pGEX-4T-1空載體作為對(duì)照。8 000 r/min,離心10 min,棄上清,菌體樣品加入30 μL 2×上樣緩沖液和50 μL ddH2O,混勻,在100 ℃的沸水中煮沸10 min,冰上冷卻后,取10 μL進(jìn)行 SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)電泳檢測(cè)。電泳后經(jīng)考馬斯亮蘭染色、拍照,分析蛋白表達(dá)結(jié)果,確定最適IPTG誘導(dǎo)濃度。

按上述方法,以終濃度為1 mmol/L IPTG進(jìn)行重組菌株表達(dá)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá),以相同條件的pGEX-4T-1轉(zhuǎn)化菌為對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)0、2、4和6 h后分別收集菌液,進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠,12%分離膠)電泳檢測(cè),分析蛋白表達(dá)結(jié)果,確定最適培養(yǎng)時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhHSP70基因克隆與序列分析

以棉花葉片cDNA為模板,利用引物GhHSP70-F和GhHSP70-R,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得一條大約2 kb左右的特異條帶(圖1)。通過(guò)T-A克隆將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上,獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-HSP70,測(cè)序結(jié)果表明該基因ORF為1 997 bp,5′末端長(zhǎng)為170 bp,3′末端長(zhǎng)202 bp編碼含648個(gè)氨基酸殘基蛋白;利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的理論分子量為 70.94 kD,等電點(diǎn)為4.83。

同源性比對(duì)分析表明,棉花HSP70具有3個(gè)典型的HSP70簽名基序序列(IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSLL、VVLVGGSTRIPKVQQ),其在氨基酸序列中所處的位置基本上相同,C-端特征基序均為EEVD,所得氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast分析表明,第9個(gè)氨基酸到第618個(gè)氨基酸為該序列的結(jié)構(gòu)域(圖4)。GhHSP70編碼的氨基酸

序列與已報(bào)道其他植物的HSP70序列都具有高度的同源性,其中與歐洲大葉楊HSP70的氨基酸水平一致性達(dá)到96.4%,表明HSP70進(jìn)化的保守性。

將棉花HSP70的氨基酸序列與其他已報(bào)道植物的HSP70進(jìn)行多序列比對(duì),利用CLUSTALW和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。從圖3可以看出,棉花(Gossypiumhirsutum)HSP70與歐洲大葉楊(Populustrichocarpa)HSP70為同一分支,說(shuō)明棉花與歐洲大葉楊在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近。

利用DNAStar軟件的protean程序?qū)γ藁℉SP70氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3)。結(jié)果表明,該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、 β-折疊、轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲組成。利用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對(duì)棉花HSP70蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè),表明棉花HSP70蛋白無(wú)跨膜區(qū),預(yù)測(cè)結(jié)果如下(圖5)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖1.RT-PCR產(chǎn)物;M.DL2000

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖3 GhHSP70二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)標(biāo)尺表示蛋白序列區(qū)段

圖4 棉花與其他植物的HSP70的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果劃線部分為GhHSP70結(jié)構(gòu)域,陰影部分表示同源氨基酸殘基、簽名序列和胞質(zhì)HSP70 C-末端特征基序標(biāo)出;CsHSP70.黃瓜(XP_004142749.1);JcHSP70.桐油樹(shù)(KDP44981.1);MdHSP70.蘋(píng)果(XP_008370710.1);MnHSP70.川桑(EXB58128.1);NtHSP70.煙草(AAR17080.1);ObHSP70.短花稻(XP_006663128.1);OSHSP70.水稻(NP_001068540.1);PtHSP70.歐洲大葉楊(XP_002311161.1);TcHSP70.可可(XP_007009362.1);VvHSP70.葡萄(XP_002284008.1);GhHSP70.棉花(ACJ11742)

2.2 GhHSP70基因原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)分析

對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GhHSP70進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),電泳結(jié)果見(jiàn)圖6,在1 997 bp位置處有1條目的條帶與預(yù)期結(jié)果一致,同時(shí),該重組載體插入DNA片段的測(cè)序結(jié)果與棉花HSP70基因序列完全相同,表明棉花HSP70基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖5 TMHMM工具預(yù)測(cè)結(jié)果圖

圖6 pGEX-4T-1-GhHSP70菌液PCR

圖7 IPTG終濃度對(duì) HSP70蛋白表達(dá)的影響M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;1.pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo);2.pGEX-4T-1空載體經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h;3.pGEX-4T-1-GhHSP70未誘導(dǎo);4～8.pGEX-4T-1-GhHSP70分別經(jīng)終濃度為0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h

圖8 IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HSP70蛋白表達(dá)的影響M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量;1.pGEX-4T-1空載體未誘導(dǎo);2.pGEX-4T-1空載體經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h;3.pGEX-4T-1-GhHSP70未誘導(dǎo);4～6.pGEX-4T-1-GhHSP70經(jīng)0.5 mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)2、4和6 h

在37 ℃下,在終濃度為 0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG與不加IPTG下,分別對(duì)含重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GhHSP70的大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)4 h,對(duì)pGEX-4T-1空載體在0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h,其表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示,在5個(gè)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下,均能誘導(dǎo)出融合蛋白,且所表達(dá)蛋白與預(yù)期蛋白大小一致,而pGEX-4T-1空載體則沒(méi)有融合蛋白表達(dá),表明0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)就獲得最佳的蛋白誘導(dǎo)效果。

在37 ℃下,用IPTG(0.5 mmol/L)誘導(dǎo)棉花HSP70重組蛋白表達(dá),分別誘導(dǎo)0、2、4和6 h。發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時(shí)間為2、4和6 h,均能誘導(dǎo)出融合蛋白,其中誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量就已達(dá)到最大值。而經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h的pGEX-4T-1空載體則沒(méi)有融合蛋白表達(dá)(圖8)。

3 討 論

HSP70是研究最多、在生物體內(nèi)分布最廣、進(jìn)化上最保守的一類熱激蛋白,在植物受到高溫、干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫時(shí)可迅速并短時(shí)表達(dá),以減少植物細(xì)胞受到的傷害。長(zhǎng)期以來(lái)一直受到人們重視。而在各種非生物脅迫中,干旱對(duì)棉花產(chǎn)量的影響占首位,可以導(dǎo)致棉花細(xì)胞脫水、膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)遭到破壞、細(xì)胞功能喪失等[15]。因此,運(yùn)用基因工程手段發(fā)掘和克隆抗旱基因,分離出與棉花抗旱品質(zhì)緊密相關(guān)的基因顯得至關(guān)重要,對(duì)于今后培育抗旱棉花新品系具有重大意義。

本研究則根據(jù)前期采用蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)和生物信息學(xué)方法,對(duì)抗旱性較強(qiáng)的棉花品種‘KK1543’進(jìn)行研究,獲得了113個(gè)在干旱脅迫下差異表達(dá)的蛋白。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)點(diǎn)1312為棉花HSP70蛋白,推測(cè)該蛋白可能在干旱脅迫應(yīng)答中具有功能。因此以獲得的差異蛋白HSP70的氨基酸序列為基礎(chǔ),利用RT-PCR技術(shù)成功克隆出棉花HSP70基因,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析,發(fā)現(xiàn)棉花HSP70與已報(bào)道其他植物的HSP70均有較高的同源性,其中與歐洲大葉楊HSP70具有的氨基酸水平一致性最高,蛋白親緣關(guān)系最近。棉花HSP70氨基酸序列存在真核細(xì)胞HSP70家族的三個(gè)特征標(biāo)簽以及真核細(xì)胞特征基序,含有四肽重復(fù)序列GGMP和ATP結(jié)合位點(diǎn)的特征性基序DLGTT-S-V(13-21)。 具有細(xì)胞質(zhì)定位的HSP70 C-末端特征基序EEVD。

外源基因在大腸桿菌中能否高效表達(dá)受很多因素的影響,如大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)劑濃度、溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等[16]。有報(bào)道指出,0.1～1 mmol/L范圍內(nèi)的IPTG均適于重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)[17],而低濃度的IPTG可以減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷[18]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)將IPTG濃度確定為0.2 mmol/L,在37 ℃下誘導(dǎo)2 h時(shí)重組蛋白表達(dá)量就已達(dá)到最大值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該濃度誘導(dǎo)棉花HSP70重組蛋白表達(dá)是可行的。并為下一步純化GhHSP70蛋白以及研究其功能提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。GhHSP70基因在大腸桿菌中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,為以后進(jìn)一步將HSP基因應(yīng)用到棉花抗旱的實(shí)際育種工作中提供了有利的理論基礎(chǔ)。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Prokaryotic Expression of Heat ShockProtein 70 Gene inGossypiumhirsutumL.

LIU Na,QU Yanying,CHEN Quanjia,NI Zhiyong*

(College of Agronomy,Xinjiang Agricultural University,Key Laboratory of Agricultural Biological Technology,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

In this study,the strong drought-resistant cotton variety ‘KK1543’ was used as the material.RT-PCR method was used to clone aHSP70 gene,a gene coding forGhHSP70 was isolated from cotton (GossypiumhirsutumL.).The open reading frame was 1 997 bp,encoding 648 amino acid residues with a predicted molecular mass of 70.94 kDa and a basic isoelectric point of 4.83.Homology analysis and phylogenetic tree analysis founded that GhHSP70 shared 96.4% amino acid identity with the HSP70 fromPopulustrichocarpa,and GhHSP70 protein is close to PtHSP70.An expression vector pGEX-4T-1-GhHSP70 was constructed.Then,the recombinant plasmid was transformed intoEscherichiacoli.The SDS-PAGE results displayed that the expressed protein was consistent with the anticipated size.The expressed protein quantity induced by 0.2 mmol/L IPTG treatment for 2 h at 37 ℃ is the highest.This study provide a fundamental condition supporting research on function ofGhHSP70 gene.

cotton;heat shock protein 70;gene cloning;prokaryotic expression

1000-4025(2015)04-0688-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.04.0688

2014-12-17;修改稿收到日期:2015-01-30

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211A025)

劉 娜(1990-),女,在讀博士研究生,主要從事棉花分子育種研究。E-mail:416549170@qq.com

Q785;Q786

A

*通信作者:倪志勇,博士,副教授,主要從事植物逆境分子生物學(xué)研究。E-mai:nizhiyong@126.com