李安峰，駱堅平，黃 丹，潘 濤

(北京市環(huán)境保護科學研究院國家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

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傳統(tǒng)活性污泥法和膜生物反應器馴化期微生物群落組成特征

李安峰，駱堅平，黃 丹，潘 濤

(北京市環(huán)境保護科學研究院國家城市環(huán)境污染控制工程技術(shù)研究中心，北京 100037)

[目的]比較傳統(tǒng)活性污泥法(S1)和膜生物反應器(MBR,S2)工藝微生物群落之間的差異。[方法]通過MiSeq高通量測序平臺，分析處于馴化期的S1和S2工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)組成。[結(jié)果]從S1和S2分別獲得47 354和51 882條有效序列，平均長度為253 bp。在97%相似性水平下，從S1和S2分別可確定2 693和3 208個操作分類單元(OTU)，其中有1 156個OTU為相同單元。S1和S2的豐度指數(shù)(Chao 1)分別為6 639.3和9 564.1，Shannon指數(shù)為9.03和9.13。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，兩種處理系統(tǒng)中活性污泥的優(yōu)勢菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)；同時，硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在MBR中更易富集，所占比例要高于傳統(tǒng)活性污泥法。[結(jié)論]在馴化期中，MBR和傳統(tǒng)活性污泥法均具有較高的微生物多樣性以及相似的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)。由于對微生物的高效過濾作用，馴化期MBR中微生物群落多樣性更為豐富。

傳統(tǒng)活性污泥法；膜生物反應器；高通量；微生物群落

污水處理系統(tǒng)中，馴化期是微生物群落對環(huán)境因子和操作條件處于逐漸適應的階段，與穩(wěn)定運行期相比，微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異[1-2]。因而，了解處于馴化期污水處理系統(tǒng)的微生物組成對于工藝的設計、調(diào)試和穩(wěn)定運行具有指導意義。然而，污水處理系統(tǒng)中微生物群落是極其復雜的。由于能夠被純培養(yǎng)的微生物在環(huán)境中的比例只有0.1%～10.0%，因此采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)進行污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析局限性較大，無法獲取足夠的微生物信息[3]。20世紀90年代以來，以核酸技術(shù)為主要內(nèi)容的分子生物學技術(shù)，例如原位熒光雜交法(FISH)、聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳(PCR-DGGE/TGGE)、末端標記限制性片段長度多態(tài)性(T-RFLP)、16S rRNA克隆文庫構(gòu)建、實時PCR等，極大地克服了微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足，可以在分子水平評價群落多樣性，揭示生物與環(huán)境之間的作用機制等[4-5]。Rosenkran等通過DGGE分析發(fā)現(xiàn)，當進水苯酚濃度從120 mg/L增加到800 mg/L時，厭氧序批式反應器中微生物群落結(jié)構(gòu)并沒有明顯變化，但是當苯酚進水濃度從800 mg/L上升到1 200 mg/L時，微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了急劇變化，其中優(yōu)勢菌由Spirochaetaceae、Anaerolineaceae變?yōu)锳naerolineaceae[6]。通過T-RFLP對A/O-MBR系統(tǒng)微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)不同膜污染時期，好氧池中微生物結(jié)構(gòu)也隨著變化，在膜污染初期，好氧池中微生物以Thiothrixsp.為主；當膜污染加劇時，Zoogloearamigera則取代Thiothrixsp.成為優(yōu)勢菌種[7]。DGGE結(jié)果表明，利用不同接種污泥而相同厭氧工藝處理奶酪廠生產(chǎn)廢水時，污泥微生物群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高度一致性[8]。但是，這些技術(shù)由于存在操作引起的誤差大、步驟繁雜等問題，為其應用帶來了許多限制[9-10]。

近年來，作為第二代測序技術(shù)的高通量測序得到了快速的發(fā)展和應用，如454焦磷酸高通量測序、MiSeq高通量測序等。高通量測序技術(shù)一次可以對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序，可以對物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行全貌分析[11-12]。Hu等采用454焦磷酸高通量測序技術(shù)對不同MBR污水處理系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，有些污水廠活性污泥中Proteobacteria為優(yōu)勢菌種，而有些污水廠活性污泥中則以Bacteroidetes為主，并且通過S?rensen相似性指數(shù)及主成分分析發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)總體相似性不是很高[13]。筆者通過MiSeq高通量測序平臺，對馴化期MBR以及傳統(tǒng)活性污泥法工藝的微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析，為工藝的調(diào)試和優(yōu)化提供微生物學方面的信息。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗裝置該試驗采用好氧平板式MBR以及傳統(tǒng)活性污泥法處理小區(qū)生活污水。反應器有效容積均為120 L，試驗過程中溶解氧均控制在2 mg/L左右。MBR和傳統(tǒng)活性污泥法均處于馴化期，馴化時間2個月。其中，MBR膜組件有效膜面積為1 m2，材質(zhì)為聚偏氟乙烯(PVDF)，孔徑<0.1 μm，購自上海斯納普公司。MBR抽停比為6∶2，污泥濃度為4 g/L，HRT為8 h。傳統(tǒng)活性污泥反應器MLSS為1.5 g/L左右，HRT=8 h。小區(qū)生活污水進水COD、TN分別在200～800，50～120 mg/L之間波動，該試驗接種污泥均取自某污水處理廠二沉池所排出的剩余污泥。

1.2 主要試劑及儀器Omega土壤DNA小量提取試劑盒(美國Omega公司)；Nanodrop ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；CFX 96實時定量PCR儀(美國BIORAD公司)；離心柱型超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；Illumina MiSeq測序儀(美國Illumina公司)；引物合成、MiSeq高通量測序和生物信息學分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.3 微生物多樣性分析

1.3.1DNA提取與PCR擴增。分別提取傳統(tǒng)活性污泥反應器(S1)和MBR(S2)中的污泥混合液。首先利用Omega土壤DNA小量提取試劑盒提取兩組樣品的DNA，DNA的濃度與純度利用分光光度法檢驗。其中，DNA濃度通過測定其在260 nm下吸光度確定；DNA純度通過比較260 nm/230 nm(DNA/腐殖酸)和260 nm/280 nm(DNA/蛋白質(zhì))的值確定。PCR擴增區(qū)域選擇樣本16S rRNA的V4區(qū)域，16S rRNA引物序列為515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR反應體系以1 μl DNA為模板，擴增條件：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；35個循環(huán)之后，72 ℃延伸5 min。利用超薄瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并用2%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.2MiSeq高通量測序。使用Illumina的MiSeq測序儀，對16S rRNA的PCR產(chǎn)物進行雙端測序。使用QIIME軟件對測序數(shù)據(jù)進行過濾。通過flash軟件將有overlap的一對reads進行拼接。

1.3.3生物信息學分析。根據(jù)序列的相似性，在97%相似水平下，利用uparse軟件將序列歸為多個OTU(操作分類單元)。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)，做出每個樣品的稀釋曲線，同時計算各個樣品的相關(guān)分析指數(shù)，包括豐度指數(shù)(Chao 1)、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))。另外，根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)進行主成分、OTU分布Venn圖、Rank-Abundance曲線以及門水平的樣品群落結(jié)構(gòu)的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列數(shù)目通過對活性污泥樣品16S rRNA基因文庫MiSeq測序，從傳統(tǒng)活性污泥法污泥混合液樣品(S1)和MBR污泥混合液樣品(S2)各獲得47 354和51 882條有效序列，序列平均長度為253 bp。將序列與Silva庫進行比對聚類分析，在97%相似水平下，從S1和S2中分別得到的OTU數(shù)目為2 693和3 208，并共有1 156個OTU(圖1)。這表明在馴化期中傳統(tǒng)活性污泥法和MBR均具有較高的微生物多樣性，而且MBR中的多樣性可能更豐富。

2.2 主成分分析從圖2可知，與污泥混合液細菌群落結(jié)構(gòu)相關(guān)的有關(guān)主成分中，P1主成分的方差貢獻率為15.45%，P2主成分的方差貢獻率為11.97%。S1和S2所代表的點距離相近，這表明S1和S2所代表的菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異，但不是很大，這與上述兩個系統(tǒng)中OTU的分布相吻合。

2.3 Rank-Abundance曲線圖3為S1和S2樣品的Rank-Abundance(相對豐度)曲線。Rank-Abundance曲線用于同時解釋樣品多樣性的兩個方面，即樣品所含物種的豐富程度和均勻程度。物種的豐富程度由曲線在橫軸上的長度，即OTU數(shù)來反映，曲線越寬，表示物種的組成越豐富，結(jié)果與OTU分布Venn圖分析一致。物種組成的均勻程度由曲線的形狀來反映，曲線越平坦，表示物種組成的均勻程度越高。對比S1和S2的曲線可知，S1和S2的曲線的形狀均不太平坦，這意味著S1和S2中微生物群落物種的分布均勻程度不高。

2.4 微生物群落多樣性分析為了研究污泥混合液中微生物群落多樣性，選取群落豐度指數(shù)(Chao 1指數(shù))、多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))為參考標準。在97%和95%的相似水平下，S1的Chao 1指數(shù)為6 639.3/2 904.5，Shannon指數(shù)為9.03/8.23;S2的Chao 1指數(shù)為8 564.1/3 819.5，Shannon指數(shù)為9.13/8.27。馴化期中MBR污泥混合液的群落多樣性高于傳統(tǒng)污泥法污泥混合液樣品，而且MBR和傳統(tǒng)活性污泥法反應器中Shannon指數(shù)(97%)均高于之前報道[13-15]。一般認為，處于穩(wěn)定運行期的MBR的SRT較長，F(xiàn)/M較低，污泥濃度較高，這些條件更利于適應性強的菌落富集，因而MBR中微生物群落多樣性(Simpon指數(shù))要低于普通A/A/O、A/O工藝[13]。但在該研究中，由于污水處理系統(tǒng)均處于馴化期，反應器中微生物還處于增長階段，MLSS仍具有較大的上升空間，此時不同的微生物正在對系統(tǒng)條件進行適應性變化，會表現(xiàn)出較高的多樣性[16]。同時，MBR的高效過濾作用使得這種多樣性在這一時期可以得到更多的保留。當然，當環(huán)境因素和操作條件對微生物的定向選擇完成后，系統(tǒng)進入穩(wěn)定期，此時微生物群落結(jié)構(gòu)組成穩(wěn)定，種群數(shù)量較接種時期大為減少[17-18]。

2.5 樣品群落結(jié)構(gòu)分析從門分類水平的群落分析表明(圖4)，S1和S2均由11個門以及其他未知的菌類組成，其中變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)共占85%以上，其余部分如放線菌(Actinobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)、廣古菌門(Euryarchaeota)、螺旋體門(Spirochaetes)、熱袍菌門(Thermotogae)以及其他一些未知菌種僅占15%左右。在S1和S2中，變形菌門所占比例最大，主要功能為去除水中有機物[19]，其次為擬桿菌門、浮霉菌門。優(yōu)勢菌與之前的研究結(jié)果基本一致，不過次優(yōu)勢菌略有差異[20-21]。從門分類水平而言，傳統(tǒng)活性污泥法工藝和MBR工藝中微生物群落結(jié)構(gòu)相似，無顯著性差異。之前也有類似的報道，同一廢水處理系統(tǒng)不同運行工藝(A2O和倒置A2O、MBR和傳統(tǒng)活性污泥法)的微生物群落結(jié)構(gòu)有高度的相似性，這可能跟相同的進水水質(zhì)有很大的關(guān)系[22-23]。另外，S2中未知菌類所占比例更高，這與S2中生物多樣性更豐富的結(jié)論是一致的。

眾所周知，由于MBR工藝可以實現(xiàn)水力停留時間和污泥齡的完全分離，MBR工藝更有利于世代周期長的硝化菌的截留與生長。該研究中，通過對比也發(fā)現(xiàn)了該類現(xiàn)象，S2中硝化螺旋菌門比例要高于S1。

3 總結(jié)

處于馴化期的MBR和傳統(tǒng)活性污泥處理系統(tǒng)中均具有較高的微生物多樣性，而且由于MBR的高效過濾作用，其微生物群落多樣性更為豐富。在門分類水平上，兩種處理系統(tǒng)中活性污泥具有相似的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)勢菌群均為變形菌門、浮霉菌門、擬桿菌門；同時，硝化螺旋菌門在MBR中更易富集，所占比例要高于傳統(tǒng)活性污泥法。

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Microbial Community Characteristics of Traditional Activated Sludge Process and MBR in Acclimation Period

LI An-feng, LUO Jian-ping, HUANG Dan et al

(National Engineering Research Center for Urban Environmental Pollution Control, Beijing Municipal Research Institute of Environmental Protection, Beijing 100037)

[Objective] To compare the microbial community characteristics in a traditional activated sludge process (S1) and membrane bio-reactor (MBR, S2). [Method] MiSeq high-throughput sequencing was used to investigate the microbial community characteristics in S1 and S2. [Result] The results showed that 47 354 and 51 882 reads with an average read length of 253 bp were found from S1 and S2, respectively. At the similarity level of 97%, 2 693 and 3 208 operational taxonomic units (OTUs) were obtained from S1 and S2, respectively, and number of common OTUs was 1 156. The richness index (Chao 1) of S1 and S2 were 6 639.3 and 9 564.1, and Shannon index were 9.03 and 9.13, respectively. In addition, Analysis of system evolution demonstrated that Proteobacteria, Planctomycetes and Bacteroidetes were the dominant phylum in both S1 and S2. Morever, the nitrifying bacteria could be enriched more effectively in MBR, and the ratio of Nitrospirae was higher in comparison with that in the traditional activated sludge process. [Conclusion] In acclimation period, both traditional activated sludge process and MBR had very high microbial community diversity, and similar microbial community structure at phylum level. Higher diversity could be found from MBR in acclimation period due to its efficient filtration.

Traditional activated sludge process; MBR; High-throughput sequencing; Microbial community

北京市環(huán)境保護科學研究院科技基金項目(2013A07)。

李安峰(1974-)，男，山東泰安人，副研究員，博士，從事水污染控制研究。

2014-11-21

S 181.3

A

0517-6611(2015)01-189-03