方 益， 趙 凱， 周 勇， 趙巧靈*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000；3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316000；4.杭州市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測院，浙江杭州 310000)

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膽固醇氧化物分析方法研究進展

方 益1,2,3， 趙 凱4， 周 勇1， 趙巧靈1*

(1.浙江省海洋水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，浙江舟山 316000；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000；3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316000；4.杭州市質(zhì)量技術監(jiān)督檢測院，浙江杭州 310000)

介紹了膽固醇氧化物種類，綜述目前國內(nèi)外對膽固醇氧化物檢測方法：包括油脂提取、膽固醇氧化物純化、富集，及儀器分析方法對其定性、定量檢測。

膽固醇氧化物；膽固醇氧化物檢測；色譜分析

膽固醇是有機生物細胞的極為重要的組成部分，廣泛分布在所有的生物器官中[1]，但是膽固醇氧化物在光照、加熱等環(huán)境因素影響時，其內(nèi)部就會快速發(fā)生一系列氧化反應，會造成多種膽固醇氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生[2]。膽固醇氧化物可造成生物體內(nèi)DNA的損壞以及致癌性和致突變性危害[3-4]，膽固醇氧化物在血管內(nèi)聚集，也會造成血管內(nèi)膜損傷、神經(jīng)衰弱和誘發(fā)動脈粥樣硬化等慢性疾病[5]，對人體的健康有很大的潛在威脅[6]。筆者闡述了形成膽固醇氧化物的各類影響因素，以此為基礎，介紹了膽固醇氧化物的提取、富集、凈化和色譜分析方法，為分析研究膽固醇氧化物的應用檢測提供一定的理論依據(jù)。

1 膽固醇氧化物的形成機制

一般未加工過的食品中不含有膽固醇氧化物，但在加工過程中就會產(chǎn)生膽固醇氧化物，當食品在光、熱、氧等環(huán)境因素影響時，氧化反應就在膽固醇內(nèi)部快速進行，例如脫氫、脫水等反應，導致多種膽固醇氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生(圖1)[7]，其自氧化反應的速度由其側鏈的長度決定，同時一些自氧化反應需要生物活性酶的參與。膽固醇氧化發(fā)生在碳7、碳20和碳25位置上，氧化反應發(fā)生時，有一個氫會從第7位的碳上脫去，之后加一個氧形成了差向異構體：3β-羥膽固醇基-5-烯-7α-氫過氧化物和3β-羥膽固醇基-5 -烯-7β-氫過氧化物，其中后者較為穩(wěn)定[8]。第20位碳和第25位碳的位置上也可能發(fā)生脫氫，接著會形成3β-羥膽固醇基過氧化物。在此過程中，此類氫過氧化物結構不穩(wěn)定，會轉變?yōu)槠渌€(wěn)定的化合物，包括膽固醇基-5-烯-3β,7α-二醇、膽固醇基-5-烯-7-酮、膽固醇基-5-烯-3β-20α-二醇、膽固醇基-5-烯-3β,25-二醇、5,6α-環(huán)氧-5α-膽固醇烷-3β-醇、5,6β-環(huán)氧-5β-膽固醇烷-3β-醇、膽固醇烷-3β-醇和膽固醇烷-3β,5α,6β-三醇等[9]。在這些復雜的形態(tài)變化中，7-酮膽固醇是一種相當穩(wěn)定的最終產(chǎn)物。

2 膽固醇氧化物的提取

2.1 脂類物質(zhì)的提取在食品中，膽固醇氧化物溶解在脂類中，故提取膽固醇氧化物須先提取與之相溶的脂溶性物質(zhì)，例如酯化游離膽固醇、游離脂肪酸、甘油三酯等，提取的方式有：索氏抽提法、液液萃取法、超聲提取法等。在一些研究報道中，使用最頻繁的方法是以2種或者3種溶劑以不同的比例來提取，這樣可以充分地提取不同脂類物質(zhì)，同時也可以將其他非脂質(zhì)物質(zhì)去除，避免了提取液基質(zhì)的復雜性。極性和非極性基團同時存在于膽固醇氧化物中，所以使用單一的溶劑提取效果不理想，例如非極性溶劑(正己烷等)和極性溶劑(丙酮、甲醇等)單獨使用提取，不適于提取膽固醇氧化物。故需使用不同配比的混合溶劑進行提取，甲醇-氯仿體系[10]經(jīng)常被用來提取膽固醇氧化物。Hara 等采用正己烷與異丙醇(體積比為3∶2)對膽固醇氧化物提取，能夠不使用具有神經(jīng)性毒性的氯仿，已廣泛應用于對膽固醇氧化物提取[11]。也有研究報道了其他方法對膽固醇氧化物進行提取，例如加速溶劑萃取法、超臨界萃取法，雖然這些方法的萃取效率和效果都很好，但使用和維護成本較高，故沒能廣泛應用。在萃取膽固醇氧化物的過程中，要盡量避免體系與氧氣的接觸，避免膽固醇氧化物再次氧化，用正己烷來溶解提取的油脂，以供下次使用。

2.2 脂類物質(zhì)的皂化和酯交換膽固醇氧化物在提取物中是痕量級別，所提取脂類物質(zhì)中含有甘油三酯、酯化游離甾醇、游離脂肪酸等，所以必須對提取的脂類物質(zhì)進行凈化操作，但膽固醇氧化物在凈化的過程中會有損失，所以凈化方法也是整個膽固醇氧化物檢測的關鍵點?，F(xiàn)凈化方法主要有以下幾種，層析法、酯交換法、皂化法。皂化是堿水解反應，皂化目的是將脂類中甘油三酯和游離脂肪酸變?yōu)樗苄喳}類物質(zhì)，能夠更加容易除去，在該過程中膽固醇氧化物不受影響。由于油脂具有較為復雜的體系構成，會與其他脂類物質(zhì)結合，例如游離脂肪酸、苷類物質(zhì)等，而皂化可解開這些膽固醇氧化物和脂類物質(zhì)的結合。通過皂化反應，甘油三酯會轉化為水溶性鹽類，水溶性鹽類能夠溶于水相中；而膽固醇和膽固醇氧化物等不能被皂化的物質(zhì)能夠溶于有機相中，故可以加入水和有機相(如正己烷等)，從而將膽固醇氧化物與甘油三酯等皂化物分離開來。膽固醇氧化物的組成及穩(wěn)定性會被皂化過程中皂化溫度的高低所影響。過高的皂化溫度會增加膽固醇被氧化和膽固醇氧化物被再次氧化的可能性[12]，故目前多采用冷皂化，即在室溫或略高于室溫下進行皂化。皂化反應多在15 h以上，皂化完畢用有機溶劑(乙醚、石油醚、正己烷等)將未被皂化物萃取出來。

將原有的酯鍵斷裂，形成酸和醇，然后再與其他酸和醇合成新的酯，這一過程稱為酯交換反應。甲醇-甲醇鈉溶液通常作為酯交換試劑，在酯交換過程中，膽固醇酯中會發(fā)生膽固醇與甲醇互換，從而生成脂肪酸甲酯。酯交換過程可以在0.5 h內(nèi)能完成，具有反應時間短、效率高等優(yōu)點[13]。Lars Johnsson 等在植物油中加入已知量膽固醇氧化物，通過酯交換、固相萃取小柱洗脫，經(jīng)儀器分析，分析得到膽固醇氧化物回收率為 95%[14]。

3 膽固醇氧化物的富集

對膽固醇氧化物富集，一般采用SPE柱法進行富集。SPE柱法因效率高、靈敏度高、回收率高，所以越來越受到人們關注。SPE柱法的原理是，根據(jù)各種組分與吸附劑之間不同極性進行分離。膽固醇氧化物與其他物質(zhì)能夠使用SPE柱進行分離，通過不同極性溶劑淋洗和洗脫小柱，分離膽固醇氧化物和油脂中其他成分，可達到很好的分離效果。如今SPE柱經(jīng)過多年的發(fā)展，具有了很多類型，如弗羅里硅土小柱、氨基柱、氧化鋁柱、硅膠柱等；硅膠柱和氨基柱常被用于膽固醇氧化物的富集，這兩款SPE柱都為正相柱。正己烷/乙醚混合溶劑或正己烷單一溶劑并不會將膽固醇氧化物洗脫下[15]。也有研究對比了幾款SPE柱對膽固醇氧化物的富集和洗脫效果，如Penazzi等使用ODS柱和硅膠柱洗脫，前者效率最差，后者效率最好[16]。

使用氨基柱富集膽固醇氧化物，使用丙酮洗脫，但洗脫液中會含有一定的雜質(zhì)，會影響氣-質(zhì)分析，故需要進一步凈化[17]。Guardiola 等研究發(fā)現(xiàn)，洗脫溶劑會對回收率產(chǎn)生影響，使用正己烷-乙醚混合溶劑洗脫時，回收率最高[18]。Pizzoferrato 等對樣品先進行皂化處理，再使用 TLC 法分離不可皂化物，以乙酸∶正己烷∶乙醚=1∶40∶60作為展開劑，分離出膽固醇氧化物[19]。

4 膽固醇氧化物的衍生

膽固醇氧化物具有高沸點、雙性基團、化學不穩(wěn)定性，故氣相色譜分析前需進行衍生反應，改變其物理性狀，能夠有利于氣相色譜分析時分離度的改善和檢測靈敏度的提高。有研究證明，膽固醇氧化物進行衍生化與非衍生化對比分析中發(fā)現(xiàn)，衍生化對色譜分析效果更好[20]。常用衍生試劑有BSTFA (N,O-雙三甲基硅烷三氟乙酸胺)[21]；BTZ (N,O-雙三甲基硅烷乙酞胺∶三甲基氯硅烷∶N-三甲基硅烷咪哇，3∶2∶3)[22]；吡啶∶三甲基氯硅烷∶六甲基二硅氨烷(9∶3∶1)[23]；Sylon BFT(N,O-雙三甲基硅烷三氟乙酞胺：三甲基氯硅烷，99∶1)[24]。吡啶都存在于這些衍生反應中。室溫即可滿足反應需要，有些研究報道也在80 ℃[25]或120 ℃[26]下進行，反應時間大多數(shù)在0.5～1.0 h。

5 膽固醇氧化物的色譜分析

膽固醇氧化物的儀器測定方法有多種，包括氣相色譜法[27-28]、高效液相色譜法[29-30]、色-質(zhì)聯(lián)用法[31-32]、核磁共振[33]和酶法[34]等。常用的是氣相色譜法、高效液相色譜法和色-質(zhì)聯(lián)用法。

5.1 氣相色譜法氣相色譜法經(jīng)常被用于膽固醇氧化物的檢測，使用的色譜柱大多數(shù)為非極性、弱極性柱，如：DB-1，DB-5，CP-Si119CB等。一般多以持續(xù)升溫為主，但也有恒溫色譜分析，例如張明霞等采用恒溫色譜，幾種膽固醇氧化物得到了較好地分離[35]。

5.2 液相色譜法目前，和氣相色譜法相比，膽固醇氧化物的檢測方面使用液相色譜法還較為少見。液相色譜法在檢測膽固醇氧化物方面有幾個較為明顯的缺點：首先，液相色譜儀所使用的色譜柱的容量和分離效果達不到膽固醇氧化物所需的要求；其次，液相色譜儀的檢測器對于膽固醇氧化物的檢測就2種，紫外或者熒光檢測器，但是大多數(shù)的膽固醇氧化物均不能使用熒光或者紫外，因為它們在這些區(qū)域內(nèi)無吸收。當然，使用液相色譜法檢測膽固醇氧化物也有其獨特的優(yōu)勢，不用擔心因為加熱等原因而導致膽固醇氧化物的分解，從而影響試驗結果。

5.3 色-質(zhì)聯(lián)用法氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法統(tǒng)稱為色-質(zhì)聯(lián)用法，這2種方法可以為膽固醇氧化物的分析測定提供了較為準確、可靠的手段，在平時使用中，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為主。

5.3.1氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在分析檢測方面已經(jīng)有30多年的歷史了，在檢測研究領域具備了豐富的實踐經(jīng)驗。它兼顧了氣相色譜和質(zhì)譜的兩者各自的優(yōu)點，即氣相色譜具有較高的分離能力，質(zhì)譜具有較好的定性定量能力，在目前在世界化學分析領域中屬于較好的檢測方式之一。

色譜柱通常選用具有低流失的DB-5ms柱，進樣口溫度與柱箱溫度的設置和氣相色譜法相近，以氦氣作為載氣，質(zhì)譜端采用標準電子轟擊離子源(70 eV )，電離溫度為200 ℃，離子掃描范圍在m/z50～650。表1為幾種常見膽固醇氧化物定性定量特征離子峰。

表1 7種膽固醇氧化物的定性定量離子

5.3.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析膽固醇氧化物的研究報道較少，其主要原因有2個，其一是設備價格昂貴，普通實驗室和研究機構難以承擔；其二是液相色譜和質(zhì)譜之間串聯(lián)技術的限制。E.Razzazi-Fazeli等用該法對5，6α-epoxyeholesterol、5，6β-epoxyeholesterol、3β-eholestan，5α，6β-triol等7種氧化物使用液質(zhì)聯(lián)用儀進行了檢測研究[36]，使用乙腈和甲醇作為流動相，色譜柱選擇C18柱。

5.4 核磁共振使用核磁共振法在日常檢測研究領域較為少見，尤其是在測定膽固醇氧化物方面更加缺少，但是也有學者對此進行了研究，例如A.FONTANN等[33]，他們使用核磁共振技術對雞蛋粉和小甜餅中的膽固醇氧化物進行了定性和定量研究，因不同的膽固醇氧化物具有完全不同的核磁共振譜的化學位移，然后根據(jù)這些化學位移來進行定性定量分析研究。在核磁共振管中加入內(nèi)標物(苯甲酸甲酯)，使用氘代氯仿溶解膽固醇氧化物。

5.5 酶法從1973年開始，已經(jīng)有學者使用酶法對膽固醇進行研究，Richmand就用膽固醇氧化酶法對血清中的膽固醇進行定量研究，這種方法已經(jīng)成為醫(yī)學臨床檢測常用方法之一[37]。VeraR等在Richmand的基礎上發(fā)現(xiàn)膽固醇氧化物在與氧化酶反應后，用特定波長的光束進行測定，其吸光度與膽固醇氧化物濃度在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關系[38]，該法對于某些膽固醇氧化物是一種便捷的定量分析法。

6 結論

目前我國對食品中膽固醇氧化物研究較少，并且還未對膽固醇氧化物分析方法建立統(tǒng)一的標準，所以非常有必要建立快速、準確、高效分析食品中膽固醇氧化物的檢測方法。

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Research Progress of Analysis Methods on Cholesterol Oxidation Products

FANG Yi1,2,3, ZHAO Kai4, ZHOU Yong1, ZHAO Qiao-ling1*

(1. Zhejiang Ocean Food Quality Inspection Center, Zhoushan, Zhejiang 316000; 2. Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang, Zhoushan, Zhejiang 316000; 3. Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhoushan, Zhejiang 316000; 4. Hangzhou Institute of Calibration and Testing for Quality and Technical Supervision, Zhoushan, Zhejiang 316000)

The types of cholesterol oxidation products were introduced, the detection methods of cholesterol oxidation products at home and abroad were reviewed, including the extraction of oil, purification and enrichment of cholesterol oxidation products, the qualitative and quantitative of the method of instrumental analysis.

Cholesterol oxidation products; Detection of cholesterol oxidation products; Chromatographic analysis

浙江省科技計劃項目(2013C37077)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(201210060)。

方益(1986- )，男，浙江舟山人，助理工程師，碩士，從事色譜分析研究。*通訊作者，工程師，碩士，從事色譜分析研究。

2014-11-28

S 188

A

0517-6611(2015)02-277-03