王 偉劉 珍周 莉李 志桂建芳

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

銀鯽精巢特異的Ly-6/uPAR相關蛋白的分子克隆及其特征分析

王 偉1,2劉 珍1,2周 莉1李 志1桂建芳1

(1. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

Ly-6/uPAR基因超家族(Ly-6 SF)成員廣泛地存在于后生動物中, 開展該家族相關功能基因研究具有重要的意義。研究從銀鯽(Carassius auratus gibelio)中鑒定到一個該家族新成員, cDNA全長為570 bp, 其中開放閱讀框長度為300 bp, 編碼99個氨基酸, 生物軟件預測該蛋白含有一個LU結構域, 不含GPI錨信號序列, N端含有信號肽, 表明其可能為Ly-6基因超家族中分泌型蛋白。組織表達分析顯示, 該基因只在銀鯽精巢中特異表達, 且又是Ly-6基因超家族中一員, 因此將其命名為銀鯽精巢特異的Ly-6/uPAR相關蛋白(Carassius auratus gibelio testis-specific Ly-6/uPAR related protein, 簡稱CagTslurp)。原位雜交結果顯示, 該基因在銀鯽精巢的精原細胞, 初級精母細胞以及次級精母細胞中表達, 精子細胞中存在少量的表達, 而在體細胞中不表達。這種精巢特異的表達模式, 暗示CagTslurp在銀鯽精子發(fā)生中可能發(fā)揮了作用。

銀鯽; Ly-6基因超家族; CagTslurp; 精巢特異; 精子發(fā)生; 原位雜交

Ly-6基因家族成員被認為在哺乳動物天然免疫和適應性免疫中發(fā)揮了重要作用。該家族基因結構特點為至少含有一個保守的 LU結構域, 顯著特征是含有 8—10個半胱氨酸殘基, 這些半胱氨酸殘基會形成4—5對保守的二硫鍵模式[1,2]。大多數(shù)Ly-6家族成員只含有一個 LU結構域, 但是目前研究發(fā)現(xiàn)小鼠RoBo-1(Rodent Bone)[3]和人類CD177[4]有兩個 LU結構域, 以及人類尿激酶型纖溶酶原激活物受體(Urokinase-type plasminogen activator receptor, uPAR)[5]有三個LU結構域。根據(jù)蛋白末端是否含有GPI錨信號, 可以將該家族成員分為兩類, 一類為蛋白末端具有 GPI錨信號的膜蛋白, 主要成員包括CD59[6]、前列腺干細胞抗原(Prostate stem cell antigen, PSCA)[7]、精子頂體膜相關蛋白(sperm acrosomal membrane-associated protein 14, SAMP14)[8]等;另一類為蛋白末端不含GPI錨信號的蛋白, 其中大多數(shù)為分泌型蛋白, 包括分泌型 Ly-6/uPAR相關蛋白(Secreted Ly-6/uPAR related protein 1, SLURP-1)[9]、SLURP-2[10]、差異調(diào)節(jié)鱒蛋白(Differentially regulated trout protein 1, Drtp1)[11], 以及蛇神經(jīng)毒素(Snake neurotoxin)[12]等。

目前, 關于該家族成員的報道在人類、小鼠、果蠅以及蛇中相對較多, 如人類中目前至少存在 45個家族成員[13], 而果蠅中至少存在35個家族成員[14]。魚類中該家族成員的報道還較為缺乏, 如目前在模式生物斑馬魚中克隆鑒定的 ly-6家族成員, 僅有關于 lypd6、lye、lypd6b和CD59的報道[15,16]。研究認為家族成員的表達模式一般可分為兩種, 組織特異表達和廣泛性表達[17], 如人類中SLURP-1基因是哺乳動物中最先發(fā)現(xiàn)的分泌型蛋白, 在多個組織中表達[8], 而家族成員 SAMP14卻為精巢特異表達基因[9]; 如在小鼠中, 家族成員 Lynx-1[18]和 Lynx-2[19]主要在神經(jīng)系統(tǒng)中表達, 而Robo-1卻主要在骨和軟骨生長板中表達; 如在果蠅中, 家族成員 boudin、crooked、coiled以及 crimpled主要在胚胎發(fā)育外胚層和氣管中表達[14,20]。此外, 家族成員之間的同源性較低, 大多數(shù)成員氨基酸相似性只有 20%—30%,眾多成員的具體功能尚待研究[21]。

銀鯽具有單性雌核生殖和有性生殖的多種生殖方式, 已成為脊椎動物發(fā)育生物學研究的特殊材料之一[22,23]。在天然種群中, 銀鯽存在少量(大約5%—20%)但又極其重要的雄性成員。通過銀鯽遺傳背景差異較大的兩個克隆系間的有性交配, 篩選出優(yōu)良個體經(jīng)5 代單性雌核生殖擴群, 培育出“中科3號”新品種, 該品種具有生長快、出肉率高、抗肝臟寄生的吳李碘泡蟲以及遺傳穩(wěn)定等特點, 已成為鯽養(yǎng)殖中的主要品種[24—26]。本研究從銀鯽“中科3號”中克隆鑒定到CagTslurp, 為 Ly-6基因家族新成員,在精巢組織特異表達, 原位雜交表明 CagTslurp主要在精原細胞, 精母細胞中表達, 而精子細胞有少量的表達。CagTslurp的克隆鑒定可能為進一步研究ly-6基因家族, 以及銀鯽精子發(fā)生提供新的線索和基礎參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用銀鯽“中科 3號”, 均飼養(yǎng)在中國科學院水生生物研究所官橋?qū)嶒灮?。取性成熟銀鯽“中科3 號”的性腺(精巢、卵巢)、腦、垂體、脾臟、肝臟、腎臟、肌肉和心臟等9個組織, 液氮速凍, –80℃保存。取未受精卵、4細胞期、256細胞期、sphere時期、30%外包期、75%外包期、出芽期、5體節(jié)、26體節(jié)、受精后1天、受精后2天的胚胎液氮速凍,–80℃保存。

1.2 銀鯽CagTslurp全長cDNA克隆

提取銀鯽“中科3號”精巢組織的總RNA, 用購自Clontech公司的SMART cDNA合成試劑盒合成銀鯽精巢 cDNA 文庫, 具體文庫構建步驟可詳見SMART cDNA synthesis Kit (Clontech)操作手冊。以本實驗室銀鯽“中科3號”性腺轉(zhuǎn)錄組測序獲得的序列片段為基礎, 設計3′-RACE-F1、3′-RACE-R1和5′-RACE-F1、5′-RACE-R1引物(表1), 按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 操作說明書, 進行5′和 3′RACE, 從精巢cDNA文庫中擴增CagTslurp的5′端與3′端[27]。PCR反應條件如下: 94℃預變性2min; 94 ℃ 30s; 60 ℃ 30s; 72 ℃ 1min; 35個循環(huán)之后72℃10min; 4 ℃ 5min 。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后, 切膠回收相應的目的片段, 并克隆到pMD18-T載體上, 16℃水浴連接4h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌, 挑單克隆搖菌, PCR篩選陽性克隆送測序, 測序后進行結果比對拼接, 獲得 CagTslurp cDNA全長序列。

1.3 銀鯽CagTslurp編碼的氨基酸序列分析

通過NCBI網(wǎng)絡服務器上的ORF Finder軟件預測cDNA序列的ORF, 并翻譯成氨基酸序列。使用SignalP 3.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/)預測蛋白信號肽; Smart (http://smart.emblheidelberg.de/)對蛋白的結構域進行預測; 利用PreGPI (http://gpcr2.biocomp.unibo.it/gpipe/index.htm)對蛋白進行 GPI信號預測。ClusterX和 GeneDoc進行氨基酸多重序列比對, MEGA5.0鄰位相接法(Neighbor-Joining, NJ)構建家族系統(tǒng)進化樹, 置信度(Bootstraps)1000次檢驗各分支置信度[28]。SWISSMODEL軟件進行三維蛋白同源建模結構比較(http://swissmodel.expasy.org/)。

表1 銀鯽CagTslurp基因cDNA克隆與表達分析引物Tab. 1 Primers designed for cloning and expression analysis of gibel carp CagTslurp gene

1.4 半定量PCR和熒光定量PCR

采用Trizol與SV Total RNA試劑盒相結合的方法進行 RNA的提取, 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。逆轉(zhuǎn)錄酶Powerscrit 和oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄獲得銀鯽組織和胚胎時序 cDNA, 并以斑馬魚β-actin引物(表1)為內(nèi)參。以銀鯽CagTslurp cDNA序列為基礎, 設計特異性跨內(nèi)含子引物 CagTslurp-F1和CagTslurp-R1(表1), 半定量RT-PCR分析該基因在組織以及胚胎時期的表達狀況。熒光定量PCR檢測 CagTslurp基因在組織中的相對表達量, 實驗中每個樣品重復3次并以β-actin基因為內(nèi)參, 實驗結果用2–ΔΔCt方法[29]進行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.5 原位雜交

根據(jù)銀鯽CagTslurp基因的cDNA全長, 在引物5′端加入T7啟動子序列, PCR擴增基因的同一片段,將帶有T7啟動子的DNA片段連接到pMD18-T載體, 克隆并測序?？寺≌_的質(zhì)粒為模板進行PCR,純化回收 DNA片段, 體外轉(zhuǎn)錄獲得帶地高辛標記的反義和正義RNA探針, 1%瓊脂糖電泳檢測RNA探針的質(zhì)量。原位雜交 PCR引物 CagTslurp-F2、CagTslurp-R2、CagTslurp-F3、CagTslurp-R3(表1)。取銀鯽精巢, 于 4% PFA中 4℃環(huán)境固定 16—18h,再經(jīng)30%蔗糖4℃滲透過夜, OTC包埋后進行冰凍切片, 切片的厚度為8 μm。之后利用地高辛標記的RNA探針進行切片原位雜交, 實驗過程主要包括:切片復水、蛋白酶消化、PFA固定、雜交、洗脫、抗體孵育、染色、顯色等步驟, 具體操作步驟可參照本實驗室方法[30—32]。

2 結果

2.1 銀鯽CagTslurp cDNA序列與氨基酸序列分析

以銀鯽“中科3 號”精巢cDNA文庫為模板, 進行3′-RACE和 5′-RACE 擴增, 結果在250—500 bp分別獲得單一、明亮的目的片段, 克隆并測序, 結果3′端擴增片段大小為 497 bp, 而 5′端片段大小為343 bp。對序列進行拼接后 PCR驗證, 獲得銀鯽CagTslurp cDNA的全長序列。該序列全長為570 bp,開放閱讀框有300個核苷酸, 編碼 99個氨基酸, 5′非編碼區(qū)為 48 bp, 3′非編碼區(qū)為 222 bp, 位于poly(A)序列上游有加尾信號序列AATAA, Genbank登錄號 KP403808。PreGPI預測結果顯示該CagTslurp蛋白序列中不含GPI錨信號, Sigal P 3.0 server軟件預測結果顯示其N端含有一個長度為20個氨基酸的信號肽, 預示著 CagTslurp很可能是一個分泌型蛋白。SWISS- MODEL軟件三維蛋白同源建模結構比較結果顯示, CagTslurp蛋白的LU結構域和家族成員 Lynx-1[33]蛋白相類似, 都有“三指”結構。Smart protein在線軟件對蛋白功能結構域預測分析顯示該蛋白第 29—99位氨基酸為 LU結構域,含有10個半胱氨酸殘基構成五對二硫鍵。該蛋白的C 端存在典型的“CCXXXXCN”基序, 提示CagTslurp是Ly-6基因家族中的一名成員。

2.2 銀鯽CagTslurp氨基酸同源性分析和系統(tǒng)進化樹構建

銀鯽CagTslurp氨基酸序列經(jīng)NCBI中protein blast比對, 首先, 一致性最高的為斑馬魚未知蛋白序列, 有 53.5%的一致性; 其次為羅非魚(Oreochromis niloticus) CD59B like預測序列, 有37.8%的一致性; 與慈鯛(Pundamilia nyererei) CD59B like序列,一致性為35.6%; 再者為斑馬魚CD59B like預測序列, 一致性為34.7%; 與虹鱒(Oncorhynchus mykiss)和美洲紅點鮭 (Salvelinus fontinalis )Drtp1序列, 一致性分別為32.9%和31.8%。同時, 從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索出部分代表性物種的Ly-6基因超家族成員氨基酸序列, 利用ClusterX與GeneDoc進行家族成員序列多重比對, 比對的結果顯示家族成員之間氨基酸一致性偏低, 但序列中 8—10個半胱氨酸和末端“CCXXXXCN”基序相對保守。MEGA5.0軟件中N-J法構建 Ly-6基因家族系統(tǒng)進化樹顯示, 銀鯽CagTslurp先與斑馬魚未知蛋白在一個分支, 再與羅非魚以及慈鯛 CD59B like成為一簇, 之后與SLURP1相簇成一個亞支; 而 CD59、Drtp1和Neruotoxin先各自組成一個亞支, 再與CagTslurp所在亞支構成家族系統(tǒng)進化樹(圖1)。

2.3 銀鯽組織中CagTslurp基因表達分析

以各組織cDNA為模板, β-actin為參照基因進行半定量 RT-PCR。結果表明僅在銀鯽“中科 3號”雄魚精巢組織中擴出一條與預期大小一致的條帶,而在其他的8個組織中均未擴出條帶(圖2A), 表明銀鯽CagTslurp為精巢特異表達。熒光定量PCR結果進與半定量RT-PCR的結果相同, CagTslurp基因精巢特異表達, 其精巢中的表達量約為β-actin基因的1.4倍(圖2B)。以胚胎時序cDNA為模板, β-actin為內(nèi)參調(diào)節(jié)模板濃度后進行半定量 RT-PCR, 結果胚胎各時期都未擴出相應的目的條帶, 說明該基因在胚胎時期不表達(圖未示)。

圖1 基于NJ法構建的Ly-6家族成員的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Ly-6 superfamily factors based on N-J method

2.4 原位雜交

為了揭示 CagTslurp基因在銀鯽精巢組織的哪類細胞表達, 我們進行了原位雜交實驗。反義RNA探針結果(圖3A)顯示, CagTslurp主要在精巢精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞中表達、精子細胞中有少量表達, 體細胞中不表達。從銀鯽的精巢中可以觀察到, 其中細胞體積較大的為精原細胞, 比精原細胞體積略小的為初級精母細胞, CagTslurp信號在此類細胞中最強; 而體積比初級精母細胞略小的為次級精母細胞, 可分裂形成圓形、細胞體積更小的精子細胞。正義RNA探針作為原位雜交實驗對照, 精巢細胞中均未檢測到信號(圖3B)。

圖3 CagTslurp基因在銀鯽精巢中表達的原位雜交檢測Fig. 3 In situ hybridization detection of CagTslurp gene expression in testis of gibel carp

3 討論

本研究以銀鯽“中科 3號”為研究對象, 獲得CagTslurp基因的cDNA全長。氨基酸序列分析顯示,第29—99氨基酸為一個LU結構域, 且末端含有保守的“CCXXXXCN”氨基酸基序, 從而提示該基因是Ly-6基因超家族中的一員。家族氨基酸多重序列比對結果顯示, 其中一致性最高為斑馬魚未知蛋白序列, 有 53.5%的一致性, 其次為羅非魚預測的CD59B like, 有37.8%的一致性, 與Drtp1的一致性在20%—33%, 和SLURP、SAMP14以及Neruotoxin等成員一致性更低。構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果表明, CagTslurp首先與斑馬魚未知蛋白在一個分支, 再和預測的CD59B like以及SLURP簇為一支。對虹鱒CD59 like-1(AAT94063)和CD59 like-2 (CAI54280)的鑒定表明 CD59 like與 CD59一樣, 都含有 GPI錨[11,34]。生物信息學分析表明, 銀鯽CagTslurp蛋白, N端含有一個信號肽, C端不含GPI錨。因此本研究鑒定的銀鯽 CagTslurp不是 CD59B-like, 而應該是Ly-6超家族分泌型相關蛋白中的新成員, 且又為精巢特異表達, 所以該基因命名為CagTslurp。

Ly-6超家族成員被認為與機體的免疫過程有關。隨著研究的深入, 性腺中表達Ly-6家族成員也在逐漸被鑒定, 其功能可能是調(diào)節(jié)或保護性腺中的細胞, 使其免受機體免疫系統(tǒng)的攻擊[35]。譬如, 小鼠CD59b在睪丸高度表達, 其他組織僅有微量的表達, 研究顯示在精子頂體反應激活和維持精子活力中起重要作用[36,37]; 人類Ly-6超家族成員SAMP14精巢特異表達, 其功能與精子和卵子融合有關[9];在魚類成熟的卵母細胞以及排出的卵細胞中都能檢測到 drtp1轉(zhuǎn)錄本, 推測其功能可能與魚類的繁殖有關[35]。從組織表達分析結果上, CagTslurp與家族成員 SAMP14表達模式相同, 都為精巢特異表達,但兩者僅有15.2%一致性, 且成員SAMP14為GPI錨定的膜蛋白, 而 CagTslurp更應該是分泌型蛋白,所以CagTslurp是否會有類似于SAMP14的生物學功能還尚不清楚。

銀鯽 CagDzal的克隆鑒定與表達分析顯示, 銀鯽精子發(fā)生是一個極為復雜的細胞分化過程, 始于原始生殖細胞, 相繼經(jīng)歷精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞階段, 最后變態(tài)形成精子,會受到許多內(nèi)在和外在因素的影響[31]。CagTslurp基因精巢組織特異表達, 且原位雜交結果顯示CagTslurp主要在精原細胞和精母細胞表達, 精子細胞中有少量的表達, 體細胞中沒有表達, 暗示著其可能與銀鯽性腺發(fā)育過程中的精子發(fā)生有關, 可能是一種參與調(diào)控銀鯽精子發(fā)生基因。從原位雜交信號上分析, CagTslurp在精巢的精原細胞和精母細胞中信號更強, 在精子細胞中的信號較弱, 這暗示CagTslurp基因更可能是在銀鯽的精子發(fā)生過程中精原細胞的增殖和精母細胞的形成階段起著重要作用。本實驗室曾發(fā)現(xiàn) Spindlin基因在銀鯽卵巢特異表達并與卵母細胞成熟過程有關[38], 而 CagTslurp基因是精巢特異表達, 具體的功能與機制還有待進一步的研究。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF TESTIS-SPECIFIC Ly-6/uPAR RELATED PROTEIN IN GIBEL CARP

WANG Wei1,2, LIU Zhen1,2, ZHOU Li1, LI Zhi1and GUI Jian-Fang1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The members of Ly-6/uPAR superfamily distribute widely in many metazoans. All proteins from this family have at least one conserved Ly-6/uPAR (LU) domain which is composed of about 70 to 100 amino acids, and contain 8 to 10 cysteine residues with a defined disulfide-bonding pattern. The members of Ly-6 family are classified into two subfamilies, namely GPI-anchored membrane proteins and secreted proteins, according to whether they possess the glycophosphatidyl inositol (GPI)-anchored signal sequence in the C-terminus. In this study, we cloned and characterized a new member of Ly-6 superfamily in gibel carp (Carassius auratus gibelio). The full-length sequence of this gene consisted of 570 base pairs that encoded 99 amino acids and had only one LU domain. Our analysis using on-line bioinformatic software showed that this protein might have one signal peptide but no GPI-anchor signal sequence, thus could be a type of secreted protein. We conducted RT-PCR to detect its expression in different tissues and found that this protein was specifically expressed in testis. According to its characteristics, we named the gene Carassius auratus gibelio testisspecific Ly-6/uPAR related protein (CagTslurp). In situ hybridization revealed the expression of CagTslurp in spermatogonia, primary spermatocytes, secondary spermatocytes and spermatids, but not in somatic cells. These results indicated that the CagTslurp gene might play a role in spermatogenesis of gibel carp.

Carassius auratus gibelio; Ly-6 superfamily; CagTslurp; Testis; Spermatogenesis; In situ hybridization

Q344+.1

A

1000-3207(2015)03-0441-08

10.7541/2015.59

2014-04-22;

2014-08-15

國家自然科學基金(31123001); 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室(2011FBZ17)資助

王偉(1989—), 男, 江西上饒人; 碩士研究生; 主要研究方向為發(fā)育遺傳學。E-mail: ncussww@126.com

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn