周 瑋 蘆 珊 魏海云 苗志國

P16、E-cad和hMLH1在胃癌中發(fā)揮抑癌基因功能，常由于高甲基化而失活［1］。本研究通過檢測早期胃癌患者外周血P16、E-cad和hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討其在胃癌早期非侵入性診斷中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年1月至2014年6月間江西省腫瘤醫(yī)院腹部外科的早期胃癌標本83例，其中男性49例，女性34例，年齡22～73歲。胃鏡下取材發(fā)現(xiàn)胃癌前病變37例(腸上皮化生、中重度不典型增生、胃息肉)，其中男性21例，女性16例，年齡29～62歲。20例健康人胃粘膜組織(正常對照組)。同時留取上述研究對象外周靜脈血標本。上述組織標本均經(jīng)病理檢查證實，記錄腫瘤部位、浸潤深度、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移情況、分期等臨床病理資料。將收集的組織標本置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA 提取 用 TIANamp Micro DNA Kit提取靜脈血DNA，加入carrier RNA以提高純化效率，用30 μl滅菌雙蒸餾水洗脫，如DNA含量低可重復提取后，合并樣品并將總體積真空濃縮至30 μL。胃組織中DNA提取按照試劑盒說明書步驟提取。

1.2.2 主要試劑 基因組 DNA提取試劑盒(Boehringer Mannheim公司，德國)，Sssl甲基酶(New England Biolabs公司，美國)。

1.2.3 DNA甲基化修飾和甲基化特異性PCR(MSP)

基因組DNA的甲基化修飾使用Boehringer Mannheim公司試劑盒，1 μg的DNA通過3 mol/L NaOH變性，再通過亞硫酸氫鈉修飾，50°避光水浴過夜，未甲基化的胞嘧啶轉變?yōu)槟蜞奏ぃ谆陌奏け３植蛔?，修飾后的DNA通過乙醇沉淀會在并重懸于去離子水中，用于甲基化特異性PCR。針對P16、E-cad、hMLH1基因啟動子轉錄調(diào)控區(qū)域，參考文獻設計PCR引物。甲基化特異性的PCR反應體系為25 μl，反應條件:95°變性 10 min，特定溫度退火 45 s，延長 72°45 s，共40個擴增循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAEG)，EB染色，運用圖像采集與分析系統(tǒng)，記錄并分析電泳結果。甲基化特異性引物擴增的條帶計為甲基化(M)，未甲基化特異性引物擴增的條帶計為甲基化(U)。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理劑分析。組間比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 MSP法檢測P16、E-cad和hMLH1基因甲基化

早期胃癌外周血組P16、E-cad和hMLH1基因啟動子甲基化率分別為51.81%、46.99%和43.37%;胃癌前病變外周血組則分別為 37.84%、29.72%和29.72%;正常對照組分別為0、0和0，見表1。

2.2 聯(lián)合檢測外周血組中P16、E-cad和hMLH1甲基化情況

聯(lián)合檢測P16、E-cad和hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，以任一基因表達陽性即判定為陽性。結果顯示，聯(lián)合基因甲基化在早期胃癌組陽性率為77.11%，癌前病變組為56.76%，見表1。

表1 外周血中P16、E-cad和hMLH1的甲基化(例，%)

2.3 基因甲基化狀態(tài)與早期胃癌臨床病理特征的關系

早期胃癌外周血組中P16、E-cad和hMLH1甲基狀態(tài)與早期胃癌患者的性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結轉移、分期均無關(P ＞0.05)，見表2。

3 討論

盡管胃癌的治療水平有顯著的進步，然而診斷胃癌時常處于較晚期，其預后很不理想。因此，有效的胃癌早期診斷生物標志物是迫切需要的。在散發(fā)性胃癌的發(fā)病中，表遺傳學改變比遺傳學改變占有更重要的地位。近20年的研究發(fā)現(xiàn)，作為表遺傳學的重要組成部分，DNA甲基化是腫瘤中最常見的分子改變之一，5＇CpG島甲基化致抑癌基因失活是引起細胞惡化的重要步驟［2-4］。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此，甲基化的診斷可以用于腫瘤發(fā)生的早期預測。國內(nèi)劉文天等做了關于DNA甲基化在胃癌診斷中的研究［5］。

有研究發(fā)現(xiàn)外周血游離DNA具有腫瘤細胞DNA的一些特征，因而提出腫瘤患者血液游離DNA可能源自腫瘤細胞［6-8］?，F(xiàn)已證實，腫瘤患者血液中，具有腫瘤生物學特征的DNA主要來源于腫瘤細胞壞死集凋亡后自然散發(fā)或增生活躍時自動釋放。因而可以通過檢測外周血DNA甲基化狀態(tài)來推測細胞的生物學特征。簡言之，通過檢測某些抑癌基因甲基化情況來篩查早期腫瘤［9-10］。我們研究發(fā)現(xiàn)早期胃癌組外周血中P16、E-cad和hMLH基因啟動子甲基化率明顯高于癌前病變組及健康人群組(P＜0.05)，該研究結果提示通過檢測外周血DNA甲基化狀態(tài)對于胃癌的早期診斷具有重要意義。腫瘤的發(fā)生是多種因素相互調(diào)控、共同作用的結果，單一基因的改變都不足以引起細胞的惡性轉化和發(fā)展，因而本研究選取P16、E-cad和hMLH1這三個有代表性的基因進行研究。本研究結果顯示聯(lián)合檢測早期胃癌患者外周血P16、E-cad和hMLH基因啟動子甲基化率均明顯高于單個基因的檢測(P＜0.05)。因此可以通過聯(lián)合多個基因的檢測來提高檢測敏感性。本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血P16、E-cad和hMLH基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期均無關(P＞0.05)，因而外周血P16、E-cad和hMLH基因啟動子甲基化檢測可以成為判斷預后的獨立因子。由于我們研究選取對象均是早期胃癌患者，因而本研究結果更能證實P16、E-cad和hMLH基因啟動子甲基化對胃癌的早期診斷具有重要價值。

表2 外周血P16、E-cad和hMLH1甲基化與胃癌臨床病理的關系/例

［1］He D，Zhang YW，Zhang NN，et al.Aberrant gene promoter methylation of p16，F(xiàn)HIT，CRBP1，WWOX，and DLC-1 in Epstein-Barr virus-associated gastric carcinomas〔J〕.Med Oncol，2015，32(4):525-529.

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