徐茂文，張　華，李　濤，張　霞，周碧君，文　明＊（.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴州貴陽55005；.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550008）

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貴州省H7亞型禽流感病毒感染的血清學(xué)和病原學(xué)分析

徐茂文1，張華2，李濤2，張霞2，周碧君1，文明1＊
（1.貴州大學(xué)動物疫病研究所，貴州貴陽550025；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550008）

摘 要：為了解貴州省近幾年H7亞型禽流感病毒感染情況，分別采集雞血清3 031份、卵黃962份、咽-肛拭子1 607份、環(huán)境土壤拭子394份及野鳥糞便122份樣本共計(jì)6 116份，采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行H7亞型禽流感病毒特異性抗體和核酸檢測。結(jié)果顯示，在雞血清和卵黃樣本中，H7亞型禽流感表達(dá)特異性抗體的陽性率分別為1.2%（37/3 031）和2.3%（22/962）；在2 123份雞咽-肛拭子、環(huán)境樣本和野鳥糞便中，均未檢測出H7亞型禽流感病毒核酸。這些結(jié)果表明貴州省家禽、野鳥和環(huán)境土壤中尚未發(fā)現(xiàn)H7亞型禽流感病毒感染。

關(guān)鍵詞：H7亞型禽流感病毒；病原；調(diào)查

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起家禽和野禽的一種高度接觸性傳染病，可呈現(xiàn)無癥狀感染或不同程度的呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋率下降以及急性敗血癥等。根據(jù)禽流感病毒囊膜蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性差異，可分為H1～N16和N1～N9，不同HA和NA之間可形成100多種亞型AIV，但并不是所有亞型AIV都為高致病性和感染人［1-2］。

H7亞型禽流感是禽流感的一種亞型，屬于一種高致病性禽流感病毒，可以感染人。近年來特別是2013年初，在上海、安徽等地發(fā)生了H7N9亞型禽流感病毒感染人病例，先后造成多人感染死亡。研究發(fā)現(xiàn)，這次出現(xiàn)的H7N9亞型禽流感病毒不是由經(jīng)典的H7N9進(jìn)化而來，而是不同亞型禽流感病毒進(jìn)行基因重組所致，對禽類呈低致病性，而對人類卻具有較強(qiáng)致病力［3-8］。與此同時(shí)，貴州省也發(fā)現(xiàn)了一例輸入型人疑似H7N9亞型禽流感病毒感染死亡病例［9］，嚴(yán)重威脅著廣大居民生命安全。為此，貴州大學(xué)動物疫病研究所在貴州省農(nóng)業(yè)委員會和貴州省動物疫病預(yù)防控制中心等單位協(xié)助下，于2013年6月～12月采集了全省9個(gè)州（地、市）45個(gè)縣（區(qū)、市）養(yǎng)禽場血樣、蛋樣和咽-肛拭子以及部分自然保護(hù)區(qū)野鳥糞便等，采用血凝抑制試驗(yàn)和RT-PCR技術(shù)進(jìn)行特異性抗體與病毒核酸片段檢測［10-11］，以期了解我省H7亞型禽流感感染狀況，為H7亞型禽流感的預(yù)防與控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1待檢樣本 采集自全省9個(gè)州（地、市）45個(gè)縣（區(qū)、市）118個(gè)監(jiān)測點(diǎn)，共計(jì)6 116份，其中雞血液樣本3 031份、雞蛋樣本962份、咽-肛拭子1 607份、環(huán)境土壤拭子394份（包括活禽交易市場和家禽屠宰點(diǎn)）和野鳥糞便122份。

1.1.2檢測試劑 H7亞型禽流感血凝診斷抗原、H7亞型禽流感陽性血清和H7亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所；RNA提取試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1H7亞型禽流感血清抗體檢測 取采集的雞血液樣本，3 000r/min離心10min，收集血清，取H7亞型禽流感血凝診斷抗原與待檢血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)（HI），若HI效價(jià)大于或等于24時(shí)判為陽性；若HI效價(jià)等于或小于22時(shí)判為陰性；若HI效價(jià)等于22時(shí)判為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)后再作判定。

1.2.2H7亞型禽流感卵黃抗體檢測 取采集的雞蛋樣本，收集卵黃，與等量氯仿混合處理，8 000 r/min離心10min后取上清，取H7亞型禽流感血凝診斷抗原與待檢卵黃處理液進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)（HI），結(jié)果判定同血清樣本檢測。

1.2.3H7亞型禽流感病毒特異性核酸片段檢測取采集的咽-肛、環(huán)境和野鳥糞便試子，用適量生理鹽水處理，3 000r/min離心10min取上清，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA樣本，再用H7亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)行檢測。若陽性對照Ct≤30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，陰性對照無Ct且無特定擴(kuò)增曲線，檢測結(jié)果成立；當(dāng)待檢樣品Ct ≤30并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，判為陽性；待檢樣品Ct ≥37時(shí)判定為陰性；待檢樣品30＜Ct＜37并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線，需重做一次，兩次結(jié)果一致即判為陽性。

2　結(jié)果

2.1H7亞型禽流感病毒血清抗體檢測結(jié)果

采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）對采集的雞血清樣本進(jìn)行H7亞型禽流感病毒抗體檢測（表1），在3 031份血清樣本中，有37份為H7亞型禽流感病毒抗體陽性，陽性率為1.2%，其中種禽場為2.7%（8/ 297）、規(guī)模場為1.1%（29/2 585）和散養(yǎng)戶為0（0/ 149）。

2.2H7亞型禽流感病毒卵黃抗體檢測結(jié)果

采用血凝抑制試驗(yàn)（HI）對采集的雞卵黃樣本進(jìn)行H7亞型禽流感病毒抗體檢測（表2），在962份雞血清樣本中，有22份為H7亞型禽流感病毒抗體陽性，陽性率為2.3%，其中種禽場為5.0%（3/60）、商品場為2.3%（19/810）和散養(yǎng)戶為0（0/92）。

2.3H7亞型禽流感病毒核酸檢測結(jié)果

采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)對收集的2 123份咽-肛、環(huán)境和野鳥糞便試子進(jìn)行H7亞型禽流感病毒核酸檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本均為H7禽流感病毒核酸陰性（表3）。

表1　家禽血清樣本H7亞型禽流感病毒抗體檢測Table 1 Detection of antibody to avian influenza virus type H7in chicken sera

表2　雞卵黃樣本H7亞型禽流感病毒抗體檢測Table 2 Detection of antibody to avian influenza virus type H7in chicken yolk

表3　H7亞型禽流感病毒核酸檢測Table 3 RT-PCR detection of nucleic acid of avian influenza virus type H7

3　討論

3.1H7亞型禽流感血清抗體

動物機(jī)體感染病原體后常常產(chǎn)生特異性血清抗體，因此特異性血清抗體常作為監(jiān)測病原體的一個(gè)重要指標(biāo)。禽流感是一種重要的人畜共患病，過去分離的H7亞型禽流感病毒多為高致病性的，但目前發(fā)現(xiàn)一些H7亞型禽流感病毒毒株對家禽是低致病性的，而對人則顯現(xiàn)高致病力［12］。因此，加強(qiáng)家禽H7亞型禽流感病毒監(jiān)測是十分重要的。本次對我省9個(gè)地（州、市）118個(gè)監(jiān)測點(diǎn)3 031份未免家禽血清樣本檢測發(fā)現(xiàn)，H7亞型禽流感血清抗體的陽性率為1.2%，其原因是：①少部分家禽可能存在H7亞型禽流感病毒感染；②在養(yǎng)禽場多次免疫的H5亞型禽流感疫苗中可能存在與H7亞型禽流感病毒的共同抗原；③H7亞型禽流感血凝診斷抗原可能存在一些交叉反應(yīng)。

3.2H7亞型禽流感卵黃抗體

蛋雞養(yǎng)殖是養(yǎng)禽業(yè)的重要組成部分。蛋雞群養(yǎng)殖時(shí)間較肉雞長，更容易受到病原體的侵染，特別是禽流感病毒。在開展家禽疫病血清學(xué)調(diào)查時(shí)，若在產(chǎn)蛋期實(shí)施血樣采集，常常引起產(chǎn)蛋雞群產(chǎn)生一定程度的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降，故一些蛋雞養(yǎng)殖場（戶）常不愿配合采血抽檢。卵黃抗體是指免疫或感染家禽所產(chǎn)的蛋中存在的針對某種特定抗原的抗體；鳥類、爬行類和兩棲類動物經(jīng)免疫或感染后所產(chǎn)生的的免疫球蛋白IgG，能通過卵黃囊運(yùn)輸至蛋黃中［13］。由此可見，可通過檢測卵黃抗體來作為監(jiān)測產(chǎn)蛋雞群免疫或感染狀態(tài)的一個(gè)重要指標(biāo)。本次對我省9個(gè)地（州、市）77個(gè)監(jiān)測點(diǎn)962份未免家禽卵黃樣本檢測發(fā)現(xiàn)，H7亞型禽流感卵黃抗體的陽性率為2.3%，較血清樣本的檢出率稍高，其原因可能是蛋雞養(yǎng)殖時(shí)間較長，H5或H9亞型禽流感疫苗免疫次數(shù)較多，而這些疫苗可能存在共同抗原所致。

3.3養(yǎng)殖環(huán)境H7亞型禽流感病毒

病原檢測是確定動物感染發(fā)病或隱性攜帶病原體的重要手段。研究表明，2013年初發(fā)生在我國上海、安徽等地的H7N9亞型禽流感病毒是由于候鳥遷徙引起亞歐大陸遷徙的野鳥（攜帶病毒）在自然遷徙過程中和中國長三角地區(qū)的鴨群、雞群攜帶的禽流感病毒進(jìn)行基因重配而產(chǎn)生［2］。地球上主要有8條候鳥遷徙路線，其中經(jīng)過我國主要有3條，即“東非西亞遷徒線”、“中亞遷徒線”和“東亞/澳大利亞遷徒線”［14-15］；在“中亞遷徒線”中，貴州省威寧草海是一個(gè)重要的候鳥遷徙地，而野生水禽是禽流感病毒重要的天然貯存者，在禽流感病毒的傳播與變異中發(fā)揮重要作用。由此可見，遷徙到貴州省威寧草海及其周圍地區(qū)的野鳥很有可能攜帶有H7亞型禽流感病毒，并傳播和感染到養(yǎng)殖場或散養(yǎng)戶飼養(yǎng)的家禽中。因此，本次調(diào)查不僅從規(guī)模養(yǎng)殖場、農(nóng)村散養(yǎng)戶、活禽交易市場和屠宰點(diǎn)等飼養(yǎng)或屠宰的雞、鴨、鵝、鴿、鵪鶉及其環(huán)境中采集棉拭子樣本，而且從威寧草海、雷公山自然保護(hù)區(qū)和貴陽野生動物園等采集野鳥糞便樣本。由于熒光定量PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、省時(shí)簡便、隨時(shí)觀察結(jié)果等特點(diǎn)，因此被選用于本次采收的棉拭子和糞便樣本中H7亞型禽流感病毒核酸的檢測，但均未檢出H7亞型禽流感病毒核酸，說明貴州省野鳥及飼養(yǎng)家禽未受到H7亞型禽流感病毒的感染或污染。

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Analysis of Serology and Pathogen of Avian Influenza Subtype H7 Infection in Guizhou Province

XU Mao-wen1，ZHANG Hua2，LI Tao2，ZHANG Xia2，ZHOU Bi-jun1，WEN Ming1
（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou，550025，China；
2.GuiZhou Center for Prevention and Control of Animal Disease，Guiyang，Guizhou，550001，China）

Abstract：To understand the infected situation of avian influenza virus（AIV）subtype H7in Guizhou Province，6 116samples in total were collected，including 3 031chicken sera and 962yolks，1 607pharyngealanal swab，394envirmental soil swabs and 122wild birds feces，for detection of the specific antibodies and nucleic acid of AIV subtype H7by hemagglutination inhibition test（HI）and quantitative RT-PCR respectively.The results showed that the positive rate of AIV subtype H7antibody were respectively 1.2%（37/ 3 031）and 2.3%（22/962）in the chicken sera and eggs，and the nucleic acid of AIV subtype H7was not detected in 2 123samples of pharyngeal-anal swabs，environmental swabs and wild birds feces.These results suggested that there are no infection of AIV subtype H7in the poultry，wild birds and environment in Guizhou province.

Key words：Avian influenza virus subtype H7；pathogen；investigation

作者簡介：徐茂文（1988-），男，重慶人，碩士研究生，主要從事家禽疫病診斷與防治研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合NZ字［2012］3007號）；貴陽市科技局農(nóng)業(yè)科技項(xiàng)目（筑科合同［2012］102號）

收稿日期：2014-09-23

中圖分類號：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1007-5038（2015）06-0159-04