閆敏鑫，黃秀芬，任慧英，劉杉杉，姜　良，李永清＊（.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島6609；.畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京00097）

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雞補(bǔ)體C3d抗血清的制備與應(yīng)用

閆敏鑫1，2，黃秀芬2，任慧英1，劉杉杉2，姜良2，李永清2＊
（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2.畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097）

摘 要：為探討補(bǔ)體因子C3d在家禽健康診斷中的意義，將雞補(bǔ)體因子C3d全長基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-C3d，然后將pET28a-C3d轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21（DE3）并以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物采用氯化鉀染色切膠法進(jìn)行純化，獲得分子質(zhì)量約35ku的C3d目的蛋白。將所得蛋白與弗氏佐劑制備疫苗免疫小鼠，制備抗雞補(bǔ)體因子C3d血清。用制備的血清與重組桿狀病毒表達(dá)的C3d蛋白進(jìn)行Western blot和間接免疫熒光（IFA）鑒定血清的特異性。進(jìn)一步應(yīng)用該血清對(duì)不同健康狀態(tài)的雞血清進(jìn)行C3d相關(guān)補(bǔ)體成份相對(duì)含量的檢測。結(jié)果雞補(bǔ)體因子C3d在大腸埃希菌中成功表達(dá)，純化的C3d蛋白免疫小鼠后制備的抗血清經(jīng)ELISA檢測抗體效價(jià)達(dá)1∶256 000。Western blot和IFA結(jié)果顯示，該血清能與重組桿狀病毒表達(dá)的C3d蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。臨床應(yīng)用試驗(yàn)表明，該血清不僅能用于檢測不同健康狀態(tài)雞血漿中C3d的表達(dá)狀況，還能用于ELISA檢測不同雞血清中C3d相關(guān)補(bǔ)體成分的相對(duì)含量差異。研究還證實(shí)雞血漿中C3d相關(guān)補(bǔ)體成分的表達(dá)因機(jī)體免疫狀態(tài)不同而存在差異，結(jié)果為了解C3d與雞體健康狀況之間的關(guān)系提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞C3d；原核表達(dá)；蛋白純化；抗血清；免疫學(xué)指標(biāo)

補(bǔ)體是存在于人和脊椎動(dòng)物血清與組織液中一類具有酶活性且不耐熱的蛋白質(zhì)，廣泛參與機(jī)體免疫防御和免疫調(diào)節(jié)功能，也介導(dǎo)免疫病理損傷作用。C3是宿主補(bǔ)體系統(tǒng)的核心分子［1-2］，在補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑、替代途徑及甘露聚糖結(jié)合凝集途徑中均起著樞紐作用。補(bǔ)體活化過程中水解生成多種補(bǔ)體片段，C3d是C3的一個(gè)最小裂解片段，在先天性免疫和獲得性免疫之間起著橋梁作用，它可以與B細(xì)胞表面的CR2/CD21（補(bǔ)體受體2）結(jié)合，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)B細(xì)胞活力，降低反應(yīng)閾值，并具有免疫佐劑效應(yīng)［3-4］。正常機(jī)體血清中C3d的含量和活性相對(duì)穩(wěn)定。病理狀況下可能被異常激活并消耗，導(dǎo)致血清中C3d水平發(fā)生改變。因此，C3d水平可作為一個(gè)衡量機(jī)體健康狀況和疾病輔助診斷的指標(biāo)。

多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，C3d分子佐劑的效應(yīng)已被廣泛應(yīng)用于新型疫苗的制備，但目前仍缺少有關(guān)雞C3d分子結(jié)構(gòu)及其單體對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)影響的研究。為探討雞C3d在家禽健康診斷中的意義，本研究利用實(shí)驗(yàn)室已成功克隆的雞C3d基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)雞C3d，制備其抗血清，并利用桿狀病毒表達(dá)的C3d檢測抗血清的特異性。進(jìn)一步用該血清檢測不同健康狀態(tài)雞血清中C3d的含量，為進(jìn)一步了解C3d含量與雞體健康狀況之間的關(guān)系以及通過血清中C3d水平檢測雞的健康狀況奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 質(zhì)粒pFB-C3d、pET28a載體、sf9昆蟲細(xì)胞、pFB-C3d-BAC質(zhì)粒由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所高技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10、表達(dá)菌株BL21 （DE3）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Balb/c雌性小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2主要試劑 ZeroBack Fast Ligation Kit、DAB、TMB為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；CellfectinⅡReagent、Platinum pfx DNA polymerase為invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker、PCR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為BioLabs公司產(chǎn)品；QIAprep Spin MiniprepKit、Gel Extraction Kit為Qiagen公司產(chǎn)品；預(yù)染蛋白marker為Thermo公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG（HRP-IgG）、HRP-His單抗為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；試驗(yàn)所用引物合成及質(zhì)粒測序均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用Oligo6軟件設(shè)計(jì)帶有EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的用于擴(kuò)增C3d的特異性引物，F(xiàn)P：5′-GAATTCGAGAAAGCCACCATGGGGACCAAGCTGA-3′，RP：5′-AACT CGAGCTAGTTGTTGTTCTCGATGCGGTAGG-3′，（下劃線表示酶切位點(diǎn)），預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度978bp。以實(shí)驗(yàn)室保存的pFB-C3d質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增C3d基因片段，PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，61℃45s，68℃1min 10s，30個(gè)循環(huán)；68℃10min?；厥漳康幕蚱闻c原核表達(dá)載體pET28a連接，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21（DE3），經(jīng)菌落PCR及酶切鑒定后測序，測序正確的陽性克隆命名pET28a-C3d-BL21（DE3）。

1.2.2目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 挑取陽性克隆單菌落接種50μg/mL卡那霉素LB液體，37℃培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的比例接種至新鮮的卡那霉素LB液體，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD 600nm值為0.6～0.8，取1mL菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照，其余加入不同濃度的IPTG（終濃度分別為0.2、0.5、1.0mmol/L），28℃、230r/min誘導(dǎo)6h，收集菌體，PBS洗2遍，冰浴超聲破碎，4℃、8 000r/min離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行100g/L SDS-PAGE電泳分析。同時(shí)設(shè)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空載體對(duì)照。將電泳后的蛋白膠一塊進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，另一塊以1∶2 500稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的His單抗進(jìn)行Western blot分析。

表達(dá)產(chǎn)物采用氯化鉀染色切膠法［19-20］進(jìn)行純化，即按上述方法對(duì)大量的重組菌裂解物進(jìn)行100g/L SDS-PAGE電泳分離，然后將凝膠放入4℃預(yù)冷的0.25mol/L KCl溶液中染色，切下目的條帶，置-20℃冰凍完全后碾碎含目的蛋白的凝膠，加適量PBS于4℃溶解，12 000r/min離心2min，取上清即為蛋白溶液，分別采用Nanodrop及Pierce BCA Protein Assay Kit測定蛋白濃度。

1.2.3抗血清的制備及效價(jià)測定 選取6只6周齡～8周齡Balb/c雌性小鼠，免疫前采集適量血清留作陰性對(duì)照，初次免疫，每只小鼠以50μg純化的C3d蛋白與等量弗氏完全佐劑進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射。間隔2周后，分別以劑量為100、150、200μg/只的蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合物進(jìn)行第2、3、4次免疫，每次免疫后12d斷尾采集血清，以純化蛋白為包被抗原建立的間接ELISA測定抗體效價(jià)。待血清效價(jià)達(dá)到所需滴度時(shí)，摘除小鼠眼球收集所有血清并測定最終抗體效價(jià)。

1.2.4抗血清的特異性鑒定

1.2.4.1Western blot鑒定 將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的表達(dá)C3d的重組桿狀病毒P2代接種sf9昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)72h后出現(xiàn)病變。分別收集感染的細(xì)胞及其培養(yǎng)上清進(jìn)行裂解，裂解產(chǎn)物經(jīng)100g/L SDSPAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上并以含50g/L脫脂奶粉的PBST封閉。然后以制備的1∶300稀釋的抗C3d小鼠血清作為一抗，1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行免疫印跡，DAB顯色進(jìn)行結(jié)果分析。

1.2.4.2間接免疫熒光（IFA）鑒定 將P2代表達(dá)C3d的重組桿狀病毒接種于生長在爬片上的sf9細(xì)胞中，在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)3d～4d出現(xiàn)病變后，棄上清用PBS洗滌1次～2次，然后用40g/L多聚甲醛室溫固定1h，0.1% TritonX-100室溫作用15min，PBS洗滌后的細(xì)胞經(jīng)5g/L牛血清白蛋白封閉30min，再經(jīng)1∶100稀釋于封閉液的抗C3d鼠血清以及1∶500稀釋于封閉液中的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG分別室溫避光作用1h（期間以PBS洗滌3次），PBS充分洗滌后加入1∶10 000稀釋的DAPI作用10min，細(xì)胞爬片固定在預(yù)先滴有封片劑（Vectashield）的載玻片上，共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.5抗血清的臨床應(yīng)用

1.2.5.1抗血清用于Western blot檢測雞血清中的C3d 分別取總蛋白濃度相等的SPF、經(jīng)沙門菌鞭毛抗原免疫及HVT和馬立克病病毒強(qiáng)毒株RBIB攻毒的雞血清，100g/L SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印封閉，然后以1∶100稀釋的抗雞C3d鼠血清以及1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG進(jìn)行Western blot，檢測雞血清中的C3d。

1.2.5.2抗血清用于間接ELISA檢測雞血清中的C3d 各取30份不同免疫狀況的雞血清，先用包被液稀釋總蛋白質(zhì)量濃度為0.5μg/mL，然后按100μL/孔包被酶聯(lián)板4℃過夜。經(jīng)PBST充分洗滌，50g/L脫脂奶粉37℃封閉1h后，用1∶100稀釋的抗雞C3d鼠血清作為一抗，1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗進(jìn)行間接ELISA，檢測上述雞血清樣品中C3d含量。對(duì)測定樣品的OD 450nm值分別采用方差分析和t檢驗(yàn)兩種方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05具有顯著性差異，P＜0.01具有極顯著差異。

2　結(jié)果

2.1目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與鑒定

將含重組質(zhì)粒的大腸埃希菌BL21（DE3）在28℃下以不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果以1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h，目的蛋白獲得高效表達(dá)，而且?guī)缀跻园w的形式存在于細(xì)菌的裂解沉淀中。100g/L SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白的分子質(zhì)量約35ku。采用氯化鉀染色切膠法純化后的目的蛋白條帶單一，濃度為1mg/mL（圖1A）。將表達(dá)產(chǎn)物和重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果目的蛋白能夠與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗His標(biāo)簽單抗特異性結(jié)合，出現(xiàn)分子質(zhì)量約為35ku的免疫印跡條帶（圖1B）。

2.2抗血清效價(jià)測定

以純化的C3d為抗包被原的間接ELISA測定制備的小鼠血清的抗體效價(jià)，以樣品的吸光度值大于2.1倍陰性對(duì)照的吸光度值判定為陽性，結(jié)果第3次免疫后抗血清的效價(jià)最高達(dá)到1∶256 000，加強(qiáng)免疫后增長趨勢不大。

2.3抗血清的特異性鑒定

以重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞sf9中表達(dá)C3d融合蛋白作為抗原的Western blot鑒定結(jié)果表明，抗血清只能與35ku的C3d融合蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而與sf9細(xì)胞的其他蛋白不發(fā)生反應(yīng)（圖2）。

經(jīng)共聚焦顯微鏡觀察IFA發(fā)現(xiàn)，抗血清能特異性識(shí)別sf9細(xì)胞中桿狀病毒表達(dá)的雞補(bǔ)體C3d，而且能顯示重組蛋白在細(xì)胞中的分布位置，說明抗血清具有良好的免疫活性（圖3）。

圖1　重組蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of recombinant protein expression

圖2　Western blot鑒定抗血清的特異性Fig.2 Western blot identification of specificity of anti-C3dserum

圖3　IFA與共聚焦顯微鏡觀察抗血清的免疫活性Fig.3 Analysis of immune activity of anti-C3dserum by IFA and cofocal microscopy

圖3B為DAPI染色的細(xì)胞核，圖3C為抗血清及Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗鼠IgG檢測的C3d 在sf9表達(dá)和分布（綠色熒光），圖3A為圖3B和圖3C合并后的圖片。由圖3A能明顯看到，DAPI染的藍(lán)色的細(xì)胞核在sf9細(xì)胞中間位置，而綠色熒光染色的C3d蛋白明顯分布在藍(lán)色的細(xì)胞核周圍，一個(gè)細(xì)胞除了細(xì)胞核外，其他部分大多應(yīng)該是細(xì)胞表面和細(xì)胞漿，所以說顯示C3d蛋白大多見于細(xì)胞表面和細(xì)胞漿。

2.4抗血清用于Western blot檢測雞血清中的C3d相關(guān)補(bǔ)體成分

分別對(duì)來自SPF、HVT免疫、RBIB攻毒及沙門菌鞭毛蛋白免疫雞的血清樣品進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)SPF雞和沙門菌鞭毛蛋白免疫雞，HVT及RBIB攻毒雞血清中除檢測到分子質(zhì)量約為120ku的C3和35ku的C3d外，還檢測到1條分子質(zhì)量約為45ku的C3b條帶（圖4）。

圖4　Western blot檢測雞血清中的C3d相關(guān)補(bǔ)體成分Fig.4 Identification of C3din chicken sera by Western blot

2.5抗血清用于間接ELISA檢測雞血清中的C3d相關(guān)補(bǔ)體成份相對(duì)含量

以純化的抗血清對(duì)30份不同健康狀態(tài)的雞血清進(jìn)行間接ELISA檢測，結(jié)果各樣品的平均OD450nm值，雖然RBIB攻毒雞、HVT免疫雞和沙門菌鞭毛蛋白免疫的雞之間差異不顯著，但它們均明顯高于SPF雞（P＜0.01）（圖5）。

3　討論

補(bǔ)體廣泛參與機(jī)體的免疫防御與免疫調(diào)節(jié)功能，因此，補(bǔ)體系統(tǒng)的活化程度是機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。補(bǔ)體系統(tǒng)的核心分子C3在其轉(zhuǎn)化酶作用下先裂解為C3a和C3b，C3b再裂解為C3c和C3d，C3c裂解片段在機(jī)體中很快被清除，而C3d是C3蛋白不能再被蛋白酶裂解但仍保持與抗原共價(jià)連接的最小片段［5］，能夠轉(zhuǎn)移至血清中穩(wěn)定存在。目前C3d作為免疫佐劑被廣泛應(yīng)用于新型疫苗的研制，其原理主要通過與抗原共價(jià)結(jié)合，為抗原與B細(xì)胞受體的交聯(lián)提供共刺激信號(hào)，增強(qiáng)B細(xì)胞活力，降低反應(yīng)閾值，并調(diào)節(jié)B細(xì)胞和T細(xì)胞間的相互作用［6-8］。然而有研究證明，過量的C3d會(huì)打破機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，從而利于疾病發(fā)生，例如血液中過量的C3d可促進(jìn)HIV的傳播［9］。此外，測定血清補(bǔ)體C3及C3d含量能輔助判斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡潛在的活動(dòng)性［10］，因此血清中補(bǔ)體C3及裂解片段C3d的檢測，對(duì)于判斷機(jī)體補(bǔ)體活化水平，了解機(jī)體的健康狀況具有重要意義。

圖5　間接ELISA檢測雞血清中C3d相關(guān)補(bǔ)體成分Fig.5 Detection of C3din chicken sera by indirect ELISA

迄今，人們對(duì)雞補(bǔ)體因子C3d單體在維持免疫功能平衡中的作用了解還很少，本研究通過原核表達(dá)以及氯化鉀染色切膠法制備了高純度的C3d重組蛋白［11］，并且制備了小鼠抗雞C3d血清。Western blot和IFA結(jié)果表明，所制備的小鼠抗C3d血清，既能與變性的C3d蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，也能與sf9細(xì)胞表達(dá)的構(gòu)象型蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，表明了該血清的特異性和良好的抗體活性，為后續(xù)用于檢測體內(nèi)C3d表達(dá)狀況奠定了基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步研究補(bǔ)體因子C3d在家禽健康診斷中的意義，我們應(yīng)用制備的小鼠抗雞C3d血清對(duì)分別來源于病毒感染、沙門菌鞭毛蛋白免疫及SPF雞的血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明相對(duì)SPF雞和沙門菌鞭毛蛋白免疫雞，HVT及RBIB攻毒雞血清中除有分子質(zhì)量約為120ku的C3和35ku的C3d外，還存在一條分子質(zhì)量為45ku蛋白條帶，而這個(gè)蛋白的分子質(zhì)量大小與C3b相符，說明雞在受到MDV病毒感染時(shí)，體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量的C3b分子。通常情況下，補(bǔ)體是以非活性狀態(tài)的酶原形式存在于血清和體液中，其含量相對(duì)穩(wěn)定，不隨機(jī)體的免疫應(yīng)答而變化，但在抗原抗體復(fù)合物或其他因子激活下，補(bǔ)體則通過經(jīng)典及旁路途徑活化，并裂解產(chǎn)生各級(jí)補(bǔ)體成份，C3是該系統(tǒng)發(fā)揮效應(yīng)功能的關(guān)鍵成份，C3d又是C3的最終裂解產(chǎn)物，因此，通過檢測C3d在不同裂解狀態(tài)下總的相對(duì)含量變化，能在一定程度上反映機(jī)體的健康狀態(tài)。本研究中，我們以ELISA測定樣品中總C3d相關(guān)補(bǔ)體成份的相對(duì)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDV的2個(gè)血清型攻毒的雞血清中C3d相關(guān)補(bǔ)體成份的相對(duì)含量均明顯高于SPF雞。這些初步的應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果說明，雞血清中C3d及其相關(guān)補(bǔ)體分子的含量或活化程度可能成為雞體健康狀態(tài)的一個(gè)免疫指標(biāo)，這對(duì)了解C3d對(duì)機(jī)體免疫功能的影響及其在禽類免疫系統(tǒng)中的重要性提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 魏后軍，王 芳，胡 波，等.兔補(bǔ)體C3d基因cDNA的克隆、鑒定及原核表達(dá)［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（2）：201-203.

［2］ 昝 琦，劉 欣，逄 越，等.補(bǔ)體C3結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展［J］.中國免疫學(xué)雜志，2014，30（4）：549-553.

［3］ Carroll M C，Isenman E.Regulation of humoral immunity by complement［J］.Immunity，2012，37（24）：199-207.

［4］ Vanden Elsen J M，Isenman D E.A crystal structure of the complex between human complement receptor 2and its ligand C3dJ.Science20113326029608-611.

［5］ Zhang Rui，Zheng Zhi-yong，Lin Jian-song，et al.The continual presence of C3dbut not IgG glomerular capillary deposition in stage I idiopathic membranous nephropathy in patients receiving corticosteroid treatment［J］.Diagn Pathol，2012（7）：109.

［6］ 馬金榮，歐陽偉，王永山，等.傳染性法氏囊病病毒VP2與C3d串聯(lián)基因重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其免疫功能研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（6）：471-475.

［7］ Bora N S，Bharati M，Valeriy V，et al.Relationship between the complement system，risk factors and prediction models in agerelated macular degeneration［J］.Mol Immunol，2015，63（2）：176-183.

［8］ Musa H H，Zhang W J，Lv J，et al.The molecular adjuvant mC3denhances the immunogenicity of FimA from type I fimbriae of Salmonella enterica serovar enteritidis［J］.J Microbiol Immunol Infect，2014，47（1）：57-62.

［9］ Kacani L，Prodinger W M，Sprinzl G M，et al.Detachment of human immunodeficiency virus type 1from germinal centers by blocking complement receptor type 2［J］.Virology，2000，74 （18）：7997-80021.

［10］ Negi V S，Aggarwal A，Dayal R，et al.Complement degradation product C3din urine：marker of lupus nephritis［J］.J Rheumatol，2000，27（2）：380-383.

［11］ 吳德芹，顏 晨，劉文華，等.多價(jià)噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37的表達(dá)及其對(duì)噬菌體增殖的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43 （2）：324-328.

Preparation and Application of Antiserum against Chicken Complement 3d

YAN Min-xin1，2，HUANG Xiu-fen2，REN Hui-ying1，LIU Shan-shan2，JIANG Liang2，LI Yong-qing2
（1.College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong，266109；2.Beijing Key Laboratory
for Prevention and Control of Infectious Diseases in Livestock and Poultry，Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing，100097，China）

Abstract：To investigate the value of chicken complement 3d（C3d）in diagnosis of avian health，the full length of C3dgene was cloned into prokaryotic expressing plasmid pET28aand constructed recombinant expression plasmid pET28a-C3d.Then pET28a-C3dwas transformed into BL21（DE3）and induced by IPTG.The desirable C3dproteins with 35ku of molecular size were isolated by cutting the gel slices that contained the right band which was stained by KCl solution.The vaccines were developed by mixing purified C3dproteins with Fred's adjuvant and inoculated into mice.The C3dantiserum raised from above vaccinated mice was identified by Western blot and immunofluoresence assay（IFA）based on C3dprotein which was expressed in sf9insect cells by recombinant baculovirus.The antiserum was further applied to detect C3dassociated complement component relative levels of serum sampled from chickens in different health status.The results showed that the mouse serum against chicken C3dwas developed by using C3d protein expressed in E.coli，which ELISA titre was above 1∶256 000.Western blot analysis and IFA showed that the antiserum could specifically bind with C3dprotein expressed by recombinant baculovirus. The clinical application test showed that the antiserum，not only can be used in detection of C3dexpression of chickens with different health status，can also be used in detection of C3dassociated complement component relative levels of serum sampled from chicken in different health status by ELISA.Our results demonstrated that there were significantly different C3dassociated complement component relative levels among chickens which were in different health status.It provided the evidence for learning the relationships between C3dassociated complement component and chicken health status.

Key words：chicken C3d；prokaryotic expression；protein purification；antiserum；immunological idex

作者簡介：閆敏鑫（1988-），女，山東泰安人，碩士，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)和免疫學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372420）；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（6122018）

收稿日期：2015-01-16

中圖分類號(hào)：S852.65；S858.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0047-05