孫秋艷，郭洪梅，沈美艷，王志遠（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊261061）

?

豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及S 基因進化分析

孫秋艷，郭洪梅，沈美艷，王志遠＊
（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東濰坊261061）

摘 要：從山東地區(qū)某大型養(yǎng)豬場疑似感染豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的仔豬腸道糞便中，利用ST細胞（豬睪丸細胞系）分離到1株病毒。通過噬斑克隆純化、病毒理化特性、間接免疫熒光（IFA）、動物回歸和RT-PCR進行鑒定。結果表明，病毒株在ST細胞形成形態(tài)均一。直徑在2mm～3mm左右、外形圓而規(guī)則噬斑，耐酸，耐胰酶，對乙醚、氯仿、熱比較敏感的RNA病毒；IFA鑒定采用共聚焦顯微鏡觀察可見特異性細胞漿內橙紅色熒光；動物回歸試驗出現(xiàn)典型豬傳染性胃腸炎臨床癥狀；RT-PCR擴增獲得與預期目的基因片段大小一致的條帶。綜合分析以上結果，證明所分離到的病毒為TGEV，將其命名為TGEV-SDW1株。參照GenBank中TGEV S基因的核苷酸序列，用RT-PCR成功擴增獲得分離株的S基因序列，并與Gen-Bank中公布的13株TGEV毒株的S基因序列進行同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結果表明，分離株S基因片段長為4 350bp，與13株TGEV毒株氨基酸同源性很高，在96.0%～99.4%之間；核苷酸同源性與TH-98株最高，可達98.2%，與DAE株同源性最低，為77.7%。核苷酸系統(tǒng)進化樹結果顯示，分離株與中國KT2親緣關系較近，處于同一分支，表明TGEV-SDW1株來自我國或我國周邊國家的變異株。

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎病毒；分離鑒定；S基因；序列進化分析

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種以豬的嚴重腹瀉、嘔吐和脫水為臨床特征的高度接觸性急性傳染病，屬于世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定必須報告的動物傳染?。?］。該病主要發(fā)生在氣溫低的冬季和春季，不同年齡的豬均易感，尤其以2周齡以下仔豬最為嚴重，病死率可達95%～100%；成年豬感染后幾乎沒有死亡，但嚴重影響豬的增重和降低飼料報酬。該病于1946年由Doyle L P等［2］在美國首次報道，隨后多個國家相繼報道發(fā)生了TGE，我國從20世紀60年代起就有TGE的報道，近些年來有進一步流行的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害［3］。因此，對病原的分離鑒定［4-6］和早期診斷對該病的防控具有極為重要的意義。本試驗從山東地區(qū)大型養(yǎng)豬場收集疑似感染TGEV仔豬的腸道糞便樣品，通過細胞分離培養(yǎng)，成功分離到一株病毒，通過蝕斑克隆純化、病毒理化特性、間接免疫熒光、動物回歸和RTPCR進行鑒定，確診分離病毒株為豬傳染性胃腸炎病毒，為探討該毒株其可能來源，擴增了分離毒株的S基因［7-8］序列，并對分離株的S基因序列進行了遺傳變異分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及毒株 豬睪丸細胞系（Swine testicle cell，ST細胞）、小鼠纖維母細胞系（L2細胞）、參考毒株TGEV-purdue株由復旦大學醫(yī)學院病原生物系王玉燕教授惠贈；所有細胞均用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，病毒增殖的維持液為含200mL/L胎牛血清的DMEM。

1.1.2主要材料 DMEM、胎牛血清為Invirogen公司產品；胰蛋白酶為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；羊抗鼠IgG-TRITC為Jackson ImmunoResearch公司產品；DAPI（4′6-二脒基-2-苯基吲哚）為Roche公司產品；多聚賴氨酸、Mowiol封片劑為Sigma-Aldrich公司產品；病毒RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為天根生化有限公司產品；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR引物為上海生工生物工程技術服務有限公司產品；TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡為Leica公司產品。

1.1.3糞樣來源 山東省某大型養(yǎng)豬場7日齡仔豬突然發(fā)病，首先嘔吐，繼而發(fā)生頻繁呈噴射狀水樣腹瀉，糞便黃色、綠色或白色，常夾有未消化的凝乳塊。病豬極度口渴，明顯脫水，體重迅速減輕，病豬2d～7d內死亡。

1.1.4實驗動物 SPF豬7日齡，購自山東省實驗動物中心，試驗期間的飼養(yǎng)管理按常規(guī)方法進行。

1.2方法

1.2.1糞樣處理 將采集的糞便樣品用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1∶5稀釋，10 000r/min離心30min，取上清液，用0.22μm的微孔濾膜濾器過濾，收集濾液，置-70℃保存作為接種材料。

1.2.2病毒的分離培養(yǎng) 將處理的病料按照營養(yǎng)液的100mL/L量分別接種于長滿單層的ST細胞和L2細胞，37℃吸附1h，然后加入含20mL/L胎牛血清的DMEM維持液，于37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)觀察1周，是否出現(xiàn)細胞病變（CPE），不出現(xiàn)CPE的病毒連續(xù)傳7代，如仍沒有出現(xiàn)CPE則視為陰性；有CPE則繼續(xù)傳代，傳代到CPE比較穩(wěn)定。

1.2.3噬斑克隆純化試驗 將ST細胞進行消化，細胞數(shù)調整至1×106個/mL，加至培養(yǎng)皿中，每皿5mL，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后；將CPE穩(wěn)定的第10代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)物做10倍系列稀釋，選取適當稀釋度，每皿1mL，每個稀釋度接種3個平皿，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中吸附2h，加營養(yǎng)覆蓋瓊脂，每皿7mL；37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～72h；用1 mL移液管挑取病毒噬斑，置入2mL完全培養(yǎng)基中，置-70℃保存，再將保存病毒按以上步驟重復進行噬斑挑取試驗，純化病毒；往已挑取病毒噬斑的平皿中加入中性紅瓊脂染色8h后觀察噬斑。并將純化的毒株命名為TGEV-SDW1。

1.2.4病毒TCID50的測定 按常規(guī)方法，將ST細胞進行消化傳代，將細胞數(shù)調整至1×106個/mL，加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔0.1mL，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成單層后，將TGEV-SDW1作10倍系列稀釋，選取適當稀釋度，每個稀釋度接種96孔板中的8孔，每孔0.1mL，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h觀察CPE情況，至96h。按Reed-Muench公式計算TCID50。

1.2.5病毒理化特性試驗

1.2.5.1病毒核酸類型的鑒定 按文獻描述的方法，用5-溴脫氧尿核苷（5-BUDR）法，取96孔長滿單層ST細胞，加入濃度為50μg/mL的5-BUDR維持液，同時設不加5-BUDR對照組。然后在試驗組和對照組中分別接種TGEV-SDW1病毒，每隔24h觀察CPE情況，至96h。按Reed-Muench公式計算TCID50。

1.2.5.2病毒抵抗力的鑒定 將分離的病毒通過相應的處理后，接種ST細胞，進行耐乙醚、耐氯仿、耐胰酶、耐酸（pH 3.0，30℃維持2h）、耐熱（60℃，30min）等試驗。

1.2.6間接免疫熒光（IFA）鑒定

1.2.6.1鼠抗TGEV高免血清的制備 將參考毒株TGEV-purdue和TGEV-SDW1株大量培養(yǎng)，病毒細胞培養(yǎng)物經-20℃反復凍融3次，4℃、3 500r/min離心15min，收集上清，4℃緩慢向上清中滴加300g/L PEG8000至終濃度80g/L，緩慢攪拌2h，4℃、9 000r/min離心2h，棄去上清，用0.5mL～1mL無菌PBS溶解沉淀，500r/min離心1min，100μL/EP管分裝，置-80℃凍存。將制備的抗原用弗氏完全佐劑乳化，分別免疫接種6周齡Balb/c小鼠5只，腹腔注射0.25mL/只；第2周用弗氏不完全佐劑乳化，0.5mL/只；再隔3d加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化，0.5mL/只。每周采血，測定血清中和抗體瓊擴效價達1∶8以上時，心臟采血，分離血清，測定中和抗體效價，該血清用作下列試驗的一抗，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6.2IFA試驗 用無水乙醇浸泡1cm2蓋玻片30min，在玻片上滴加多聚賴氨酸包被蓋玻片，將包被好的蓋玻片置于24孔細胞培養(yǎng)板，每孔1片，加入用胰酶消化好的ST細胞，每孔1mL，37℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細胞長成單層。分別將TGEV-purdue、TGEV-SDW1加入已長成單層的含細胞趴片的24孔細胞培養(yǎng)板內，37℃吸附18h，40 mL/L多聚甲醛固定，PBS洗滌3次，50g/L BSA室溫封閉1h，加入用50g/L BSA-PBS 1∶500稀釋的上述制備的鼠抗TGEV高免血清一抗，4℃過夜，PBS洗滌3次；加TRITC標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1h，PBS洗滌3次；加DAPI避光染色10min，PBS洗滌1次，5min；Mowiol封片劑粘合牢固蓋玻片與載玻片，4℃避光保存；用TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡觀察病毒情況。

1.2.7動物回歸試驗 取10只7日齡SPF仔豬，隨機分成2組，試驗組5只，對照組2只。將TGEV-SDW1細胞毒經口接種試驗組，劑量為104.59TCID50/只；對照組用同樣的方法和劑量接種無菌細胞培養(yǎng)液。觀察病毒對仔豬的致病性，同時進行病原分離。

1.2.8RT-PCR參考文獻［9-12］進行

1.2.8.1引物合成 參照GenBank中TGEV S基因的核苷酸序列設計一對引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成），Primer（Forward）：5′-GCATGAGGCATAATCTAAACATGGAA -3′；Primer （Reverse）：5′-CTGAAAAAGCTCGAGTCACTCACTG -3′；預計擴增片段長度為1 148bp。

1.2.8.2RNA的提取 將1.2.1中處理的糞便上清液、純化TGEV-SDW1、動物回歸試驗腸道病料和參考株TGEV-purdue按照病毒RNA提取試劑盒說明書進行操作，提取RNA，參考株TGEV-purdue作為陽性對照。

1.2.8.3cDNA的生成 按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書進行操作，合成cDNA。

1.2.8.4PCR反應 反應體系條件如下：模板cDNA 5μL，10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/μL dNTPs 2μL，引物各1μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，用ddH2O調整終體積至50μL。反應條件：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃5 min。反應結束后，取5μL于10g/L的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.9S基因序列進化分析

1.2.9.1引物合成 參照GenBank中TGEV S基因的核苷酸序列，設計3對引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成），見表1。

表1　TGEV S基因的引物設計Table 1 Design of primers in S gene region of TGEV

1.2.9.2RT-PCR擴增 試驗方法同1.2.8RTPCR。

1.2.9.3目的片段回收及測序 用天根公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收純化病毒的PCR產物，將其送往上海杰李生物工程技術有限公司進行測序。

1.2.9.4S基因序列分析 將得到的3個S基因片段拼接成完整的S基因序列，應用DNA Star軟件將拼接完整的S基因序列與GenBank中登錄的13株TGEV毒株的S基因序列進行同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2　結果

2.1病毒分離培養(yǎng)

將處理好的病毒液分別接種ST細胞、L2細胞，在第5代盲傳時，ST細胞與第3天出現(xiàn)輕微病變，表現(xiàn)為個別細胞變圓、融合。盲傳至第6代48h后可觀察到明顯的細胞病變（CPE），表現(xiàn)為細胞出現(xiàn)圓縮，聚集成團，少數(shù)細胞脫落，在72h后，95%單層細胞脫落，對照細胞正常（圖1）。傳至第10代時細胞病變穩(wěn)定，產生病變時間為40h。L2細胞在盲傳第7代后仍無病毒生長，初次分離的TGEV在L2細胞上很難生長，所以ST細胞［13-14］是分離病毒株的合適生長細胞，對分離到的病毒株可以做初步鑒定。

圖1　正常的ST細胞與接種后72h的ST細胞（100×）Fig.1 Normal ST cells and infected ST cells after 72h（100×）

2.2噬斑克隆純化試驗

TGEV-SDW1株在ST細胞上形成與參考毒株TGEV-purdue相同噬斑特征，噬斑形態(tài)均一，直徑在2mm～3mm左右，外形圓而規(guī)則（圖2）。

圖2　TGEV-purdue與TGEV-SDW1株在ST細胞上形成的蝕斑Fig.2 TGEV-purdue and TGEV-SDW1strain formed plaques in ST cells

2.3分離病毒TCID50的測定

TGEV-SDW1第11代培養(yǎng)物TCID50為10-4.59/0.1mL。

2.4病毒的理化特性鑒定

2.4.1病毒核酸類型的鑒定 按Reed-Muench公式計算TCID50，結果TGEV-SDW1毒株試驗組的TCID50為1×10-4.59/0.1mL，對照組的TCID50為1 ×10-4.78/0.1mL，二者的T CID50的對數(shù)差值小于1，表明5-BUDR不能抑制該株病毒的增殖，證明該株病毒的核酸類型為RNA。

2.4.2病毒抵抗力的測定 病毒抵抗力的試驗結果表明，分離的病毒株均耐酸、耐胰酶；對乙醚、氯仿、熱比較敏感。

2.5間接免疫熒光鑒定

2.5.1鼠抗TGEV高免血清的制備 免疫老鼠血清抗體的瓊擴效價達到1∶8以上時采血，中和試驗測定血清效價，鼠抗TGEV-purdue株中和抗體效價為1∶1 024，鼠抗TGEV-SDW1株中和效價為1∶256。

2.5.2IFA試驗 用TRITC標記的羊抗鼠IgG抗體，采用IFA進行鑒定，用TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡觀察情況。結果表明，共聚焦顯微鏡下觀察ST細胞的細胞核經DAPI染色后呈藍色熒光，被TGEV-SDW1株感染的細胞18h后胞漿中可見特異性橙紅色熒光，有完整的細胞形態(tài)，周圍未被病毒感染的細胞不見橙紅色熒光（圖3）。

圖3　TGEV-SDW1免疫熒光抗體鑒定結果Fig.3 The identification results of TGEV-SDW1by immunofluorescence antibody

2.6動物回歸試驗

試驗組仔豬在接種40h后出現(xiàn)典型的豬傳染性胃腸炎臨床癥狀，表現(xiàn)為短時間嘔吐，伴有黃色水樣腹瀉，體重快速下降，脫水；接種68h后死亡1只，剖檢發(fā)現(xiàn)腸管擴張，充滿液體，小腸壁變薄；第4天死亡4只，第6天全部死亡，致死率為100%，對照組正常。應用RT-PCR方法檢測死亡仔豬的腸道糞便處理液，結果TGEV均為陽性。

2.7RT-PCR的鑒定結果

TGEV-SDW1株病料處理液、純化的TGEVSDW1株和分離毒株動物回歸試驗中的腸道病料，均能擴增出與參考株TGEV-purdue相同的1 148bp目的片段（圖4），從而確定該株病毒為TGEV。對照仔豬腸道病料擴增結果均為陰性。

2.8S基因序列進化分析

將所測的TGEV-SDW1株S基因序列與GenBank中登錄的國內外13株TGEV毒株的相應序列進行同源性比較分析。結果表明，TGEVSDW1株與13株TGEV毒株氨基酸同源性很高，在96.0%～99.4%之間；核苷酸同源性與TH-98株最高，可達98.2%；與DAE株同源性最低，為77.7%。核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖5）結果顯示，TGEVSDW1分離株與KT2親緣關系較近，處于同一分支。

圖4　RT-PCR鑒定結果Fig.4 Identification results of TGEV-SDW1by RT-PCR

3　討論

圖5　TGEV-SDW1分離株S基因進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of S gene of TGEV-SDW1strain

本研究對山東省大型養(yǎng)豬場疑似感染TGEV的仔豬腸道糞便，采用較為敏感的傳代系ST細胞［15］進行了病毒分離培養(yǎng)，由于初代培養(yǎng)適應細胞比較困難所以在分離初期病料采用了含100g/L胎牛血清的DMEM稀釋，并保持pH 7.0左右，研究認為S蛋白與宿主細胞受體結合受pH的影響［16-18］。細胞病變現(xiàn)象是病毒在細胞內增殖及其對細胞產生損害的最明顯的表現(xiàn)。由于各種TGEV毒株毒力的差異，當細胞接種病毒的時候，其出現(xiàn)CPE的時間也不盡相同，某些毒株即或是盲傳多代也不出現(xiàn)病變，因此本試驗盡可能多的盲傳多代，而且等到CPE穩(wěn)定后，才對病毒進行其他鑒定。豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒均可導致仔豬腹瀉，這3種病毒均有可能在ST細胞上增殖，因此本試驗采用了蝕斑克隆純化技術。不同病毒在相同的細胞上形成的蝕斑特征不一樣，同一種病毒在同一種細胞上形成蝕斑特性一般比較穩(wěn)定，根據(jù)分離株與TGEV參考株相同噬斑特征，從而提高病毒的檢出率。通過對分離病毒理化特性的鑒定，證實該病毒是一種耐酸、胰酶，對乙醚、氯仿、熱比較敏感RNA病毒，非常符合豬傳染性胃腸炎病毒理化特性。間接免疫熒光（IFA）試驗采用自制的單克隆抗體作為一抗，TRITC標記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAPI染色，用TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡觀察，TRITC發(fā)出橙紅色熒光，DAPI可以將細胞核染成藍色，這樣可以清楚的檢測到分離病毒感染ST細胞的情況，從而提高分離病毒檢出的特異性和敏感性。為了深入研究分離病毒的致病性，采用動物回歸試驗，攻毒組仔豬出現(xiàn)特征性的TGE臨床癥狀和病理剖檢變化，因此，分離毒株對仔豬有致病性，為深入開展該株病毒的致病機理奠定了基礎。本試驗采用RT-PCR方法鑒定分離毒株，排除了細菌和PEDV感染的可能，從而保證分離的病毒為TGEV。綜合分析以上結果，證明所分離到的病毒為TGEV。

TGEV是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組編碼4種結構蛋白，其中纖突糖蛋白（S）位于病毒最外層，決定宿主細胞的親嗜性、病毒的致病性和病毒的血凝活性，同時也是誘導機體產生中和抗體的主要保護性抗原［19-22］。因此，研究S基因有利于了解TGEV的基因重組、抗原變異、病毒感染機制和基因變化的規(guī)律。本研究對TGEV-SDW1株S基因序列進行了測序分析，結果表明，分離株S基因片段長為4 350bp，與13株TGEV毒株核苷酸同源性在98.2%～77.7%，雖然分離毒株與其他13株TGEV毒株核苷酸同源性差異較大，但是氨基酸同源性卻很高，在96.0%～99.4%之間，這說明S基因點突變很多因該是無意義突變，這種突變的累積能否引起病毒特性的變化，這個問題還有待進一步研究。核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進化樹結果顯示，TGEVSDW1株與中國分離的KT2親緣關系最近，處于同一分支；與中國分離的HN2002、TS、TSX和TH-98株，韓國分離的KT3和133株，日本分離的T014株，西班牙分離的56-165株親緣關系都比較近；與韓國分離的DAE株，美國分離的NEB72-RT株，中國分離的HR/DN1株和西班牙分離的Pur46-MAD株親緣關系相距較遠，表明TGEV-SDW1株因該是來自與我國和我國周邊國家的變異株。

參考文獻：

［1］ Saif L J，Wesley R D.Transmissible gastroenteritis［M］//In Diseases of Swin（Leman A D，Straw B E，Mengeling W L eds），Iowa State University Press，Ames，IA.1992：362-386.

［2］ Doyle L P，Huthing L M.A transmissible gastroenteritis in pig ［J］.J Am Vet Med Assoc，1946，108：257-259.

［3］ 郭萬柱，劉亞剛，婁高明.獸醫(yī)病毒學［M］.四川成都：四川科學技術出版社，2003.

［4］ 姜春霞，馬廣鵬，姜艷平，等.豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離與鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2013（3）：47-50.

［5］ 丁 利，陳光達，許信剛，等.豬傳染性胃腸炎病毒陜西株的分離鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2011，47（10）：9-12.

［6］ 郭容利，倪艷秀，溫立斌，等.豬傳染性胃腸炎病毒江蘇株的分離與鑒定及其S基因序列分析［J］.華北農學報，2013，28（5）：74-79.

［7］ Weiwei H，Qinghua Y，Liqi Z，et al.Complete genomic sequence of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus SHXB isolated in China［J］.Arch Virol，2014，159（9）：2295-2302.

8 Hou YYue XCai Xet al.Complete genome of transmissible gastroenteritis virus AYU strain isolated in Shanghai，China ［J］.Virol J，2012，86（21）：1193-1195.

［9］ 王建中.豬傳染性胃腸炎病毒S基因實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（1）：66-71.

［10］ 焦 洋，姜 焱，王凱民，等.豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬博卡病毒多重PCR檢測方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2013，34（8）：71-75.

［11］ 鄭世民，周首龍，趙良友，等.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒二聯(lián)RT-PCR檢測方法的建立［J］.東北農業(yè)大學學報，2014，45（6）：57-60.

［12］ 劉 鄧，袁秀芳，徐麗華，等.豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重RT-PCR鑒別方法的建立［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（10）：1-5.

［13］ 任曉峰，佟玲，孫雪嬌，等.豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）種毒特性研究［J］.東北農業(yè)大學學報，2013，44（6）：1-7.

［14］ 魏 鳳，管 宇，肖躍強.PK15、ST細胞增殖豬傳染性胃腸炎病毒的比較研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（1）：125-126.

［15］ Ding L，Xu X，Huang Y，et al.Transmissible gastroenteritis virus infection induces apoptosis through FasL-and mitochondriamediated pathways［J］.Vet Microbiol，2012，158（1-2）：12-22.

［16］ Nash T C，Buchmeier M J.Entry of mouse hepatitis virus into cells by endosomal and nonenndosomal pathways［J］.Virology199723311-8.

［17］ Shahwan K，Hesse M，Mork A K，et al.Sialic acid binding properties of soluble coronavirus spike（S1）proteins：differences between infectious bronchitis virus and transmissible gastroenteritis virus［J］.Viruses，2013，5（8）：1924-1933.

［18］ Schwegmann-Wessels C，Bauer S，Winter C，et al.The sialic acid binding activity of the S protein facilitates infection by porcine transmissible gastroenteritis coronavirus［J］.Virol J，2011，12（8）：43-45.

［19］ 蘇君鴻，李云崗，陳樹林，等.以乳酸桿菌為載體的豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原位點DNA疫苗的構建［J］.動物醫(yī)學進展，2009，30（8）：19-23.

［20］ Zhao Q，Zhu J，Zhu W A，et al.Monoclonal antibody against transmissible gastroenteritis virus generated via immunization of a DNA plasmid bearing TGEV S1gene［J］.mAb Immunodiagn Immuother，2013，32（1）：50-54.

［21］ Yin J C，Ren X F，T ian Z J，et al.Assembly of pseudorabies virus genome based transfer vehicle carrying major antigensites of S gene o f transmissible gastroenteritis virus：Potential perspective for developing live vector vaccines［J］.Biologicals，2007，35（1）：55-61.

［22］ 秦志華，張明宇，張傳美，等.豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白抗原表位區(qū)的表達及其免疫原性分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，50（7）：22-24.

Isolation and Identification of Transmissible Gastroenteritis Virus and Phylogenetic Analysis of S Gene

SUN Qiu-yan，GUO Hong-mei，SHEN Mei-yan，WANG Zhi-yuan
（Shandong Vocational Medicine College of Animal Science and Veterinary，Weifang，Shandong，261061，China）

Abstract：A TGEV strain was isolated with ST cell line from the faeces of a suspectively TGEV-infected piglet in a pig farms of Shandong province.Identification was conducted by purified plaque，virus physicochemical properties，indirect fluorescent antibody test，animal experiment and RT-PCR.The plaque of this strain is morphologically homogeneous with diameter about 2to 3mm，round and regular at ST cell.This RNA virus is resistant to acid，pancreatic enzymes，but sensitive to ether，chloroform and heat.The visible specific cytoplasmic fluorescence was identified in the infected cells through the indirect immunofluorescence assay（IFA）；Distinct orange fluorescence was found in the cytoplast.Clinic symptom of TGE can be got from the animal experiment，and target band was obtained through RT-PCR.These results demonstrated that the isolated virus is porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV），named TGEV-SDW1 strain.S gene was amplified by RT-PCR，in which the primers were designed based on nucleotide sequence of S gene of 13TGEV strains published in GenBank.Then S gene was sequenced and analyzed.The length of S gene is 4 350bp，this result showed that amino acid homology is high in 96.0%-99.4%；the nucleotide sequence homologies compared with TH-98and DAE strain were 98.2.%and 77.7%，respectively.The results of the phylogenetic tree analysis found that TGEV-SDW1was in the same branch with KT2of China. TGEV-SDW1strain should be variants to the strains in our country and surrounding countries.

Key words：Porcine transmissible gastroenteritis virus；isolation and identification；S gene；RT-PCR；phylogenetic analysis

作者簡介：孫秋艷（1978-），女，山東單縣人，講師，碩士研究生，主要從事預防獸醫(yī)學研究。＊通訊作者

基金項目：山東省生豬產業(yè)體系濰坊實驗站項目（SDAIT-06-021-12）；山東省濰坊市科學技術發(fā)展計劃項目（201301141）

收稿日期：2014-12-17

中圖分類號：S852.659.6；Q789

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0007-06