朱梅勝，張新兵，張　毅，徐守振，曹志偉，李　超，劉琳琳，郭妍妍，尹燕博＊（.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島6609；.青島藍(lán)十字動(dòng)物醫(yī)院，山東青島6609；.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島660；.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島660）

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致?tīng)倥３鲅愿篂a病原的分離與鑒定

朱梅勝1，張新兵2，張毅3，徐守振1，曹志偉1，李超1，劉琳琳1，郭妍妍4，尹燕博1＊
（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109；2.青島藍(lán)十字動(dòng)物醫(yī)院，山東青島266109；
3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032；4.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東青島266101）

摘 要：為查明山東某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)犢牛出血性腹瀉的病因，采集患病牛糞便，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢、生化鑒定和16SrRNA測(cè)序分析，接種MDBK細(xì)胞分離病毒，運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)分離的病毒，并進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，分離的細(xì)菌為大腸埃希菌，血清型鑒定為O8型，且該菌耐藥性嚴(yán)重。分離到的病毒為基因2型牛病毒性腹瀉病毒。初步判定該病是由致病性大腸埃希菌O8和基因2型牛病毒性腹瀉病毒混合感染引起。

關(guān)鍵詞：犢牛；出血性腹瀉；大腸埃希菌；牛病毒性腹瀉病毒；分離鑒定

犢牛腹瀉是肉牛養(yǎng)殖中的高發(fā)病，造成巨大的損失。引起肉牛腹瀉及血便的原因很多，病因復(fù)雜，通常由病原微生物引起，如由致病性大腸埃希菌、沙門菌、梭菌等引起的細(xì)菌性腹瀉；由牛病毒性腹瀉病毒、輪狀病毒、冠狀病毒等引起的病毒性腹瀉；由球蟲(chóng)等引起的寄生蟲(chóng)性腹瀉。因此對(duì)牛群進(jìn)行全面檢查，進(jìn)行病原分離鑒定十分必要。

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一種極為復(fù)雜、呈多臨床類型表現(xiàn)的疾?。?］。自1946年Olafson P［2］首次報(bào)道以來(lái)，本病在世界各地均有發(fā)生，尤其在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)，這種疾病的發(fā)生更為嚴(yán)重，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。目前，我國(guó)20多個(gè)省、市、自治區(qū)分離到牛病毒性腹瀉病毒或查出了該病毒的抗體［4-5］。BVDV感染引起的免疫抑制增強(qiáng)了其他病原體的致病性。其后果是損害機(jī)體的免疫機(jī)能，增強(qiáng)其他病原體如副流感病毒3型、傳染性鼻氣管炎病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、巴氏桿菌、沙門菌、大腸埃希菌、球蟲(chóng)等的致病性。1885年，Escherion發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌，在很長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)一直作為正常腸道菌群的組成部分，認(rèn)為是非致病菌。直到20世紀(jì)中葉，人們才認(rèn)識(shí)到一些特殊血清型的大腸埃希菌對(duì)人和動(dòng)物有致病性，尤其是對(duì)幼畜常引起嚴(yán)重的腹瀉和敗血癥［6］。

2012年春，山東某牛場(chǎng)出現(xiàn)犢牛腹瀉病例，病牛體溫升高，少食，消瘦，糞便呈水樣，且?guī)в写罅垦杭懊撀淠c黏膜。為了查明引起該病例的致病原，我們采集了病牛糞便，進(jìn)行了細(xì)菌和病毒的分離鑒定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源與采集 山東省某肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)1 頭6月齡肉牛，由直腸無(wú)菌采取患牛糞便，送往實(shí)驗(yàn)室檢查鑒定，部分病料用于細(xì)菌、病毒分離，部分病料置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2菌株與細(xì)胞 大腸埃希菌DH5α、牛胚腎細(xì)胞（MDBK）均由青島澳蘭百特生物工程研究院保存。

1.1.3主要試劑 DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，Taq DNA聚合酶，dNTP，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，pMD19-T Vector，DNA液體純化試劑盒為寶生物工程（大連）技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品。EasyPure Viral DNA/RNA Kit購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司。營(yíng)養(yǎng)肉湯、血瓊脂營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)、麥康凱瓊脂為廣州環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。DMEM、馬血清、胰蛋白酶、雙抗等為GIBCO公司產(chǎn)品。標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。生化鑒定管和藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑公司。

1.1.4引物 根據(jù)GenBank中所公布的基因序列，設(shè)計(jì)BVDV 5′-UTR非翻譯區(qū)序列引物P1、P2。參照柳強(qiáng)等［7］合成了牛冠狀病毒（Bovine coronavir-

us，BCV）的N蛋白和牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）的VP6基因上的一段保守區(qū)域各合成一對(duì)特異性引物P3、P4和P5、P6。合成細(xì)菌16S rRNA通用引物27F、1492R。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，稀釋成25mmol/L，置-20℃保存（表1）。

表1　BVDV、BCV和BRV引物Table 1 The primers of BVDV，BCV and BRV

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的分離與鑒定

1.2.1.1細(xì)菌分離培養(yǎng) 將糞便接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h。觀察其溶血情況并挑取單個(gè)菌落接種于麥康凱（MAC）培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。觀察其菌落特征，選取在麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色的單個(gè)菌落于肉湯培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.1.2生化鑒定 將上述分離純化的病原菌接種于大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后，按常規(guī)方法［8］對(duì)分離株進(jìn)行三糖鐵斜面試驗(yàn)（TSI）、糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、枸櫞酸鹽試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)。37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。

1.2.1.3PCR檢測(cè) 按照全式金EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取分離菌DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：超純水17μL，10×PCR buffer（Mg2+free）3μL，MgCI24μL，dNTPs 2.5μL，Taq酶0.5μL，16S上下游引物各0.5μL，模板2μL，總體積為30μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，（94℃30s，55℃30s，72℃50s）30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖核酸凝膠電泳，純化回收PCR產(chǎn)物送華大基因工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.1.4O抗原制備及血清型鑒定 已純化培養(yǎng)的菌株劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)24h。用5g/L石炭酸生理鹽水2mL洗脫菌苔，制成濃稠菌懸液，121℃高壓2h，破壞其K、H抗原，得到O抗原。通過(guò)玻板凝集試驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)O型分型血清，對(duì)分離的菌株進(jìn)行血清型鑒定。同時(shí)以檢測(cè)抗原與石碳酸生理鹽水混合物作對(duì)照，觀察有無(wú)自凝現(xiàn)象。1min內(nèi)出現(xiàn)明顯的凝集判為陽(yáng)性。

1.2.1.5藥物敏感性試驗(yàn) 采用K-b法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，記錄抑菌圈直徑，并根據(jù)由杭州微生物試劑有限公司提供判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性的判斷。

1.2.2病毒的分離與鑒定

1.2.2.1糞便處理 取牛血便樣品，加入4倍體積的生理鹽水，振蕩搖勻，以12 000r/min 4℃離心5min，吸出上清液加入適量的雙抗，4℃處理1h，12 000r/min 4℃再離心1min，取上清液用于病毒分離。

1.2.2.2病毒分離培養(yǎng) MDBK傳代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，用PBS洗3次，將2mL處理好的糞便上清液接種MDBK細(xì)胞，37℃吸附1h后加細(xì)胞維持液，同時(shí)接種2mL PBS作為陰性對(duì)照。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后收毒，72h無(wú)細(xì)胞病變，盲傳下一代。

1.2.2.3RT-PCR檢測(cè) RNA的提取，按照全式金EasyPure Viral DNA/RNA Kit說(shuō)明書(shū)提取糞便上清和細(xì)胞培養(yǎng)物總RNA，提取的RNA溶解于50 μL DEPC處理水中，即用或-70℃分裝保存。BVDV、BCV和BRV cDNA的制備。20μL反轉(zhuǎn)錄體系：超純水11μL、5×RT buffer 4μL、dNTP 2μL，RNA酶抑制劑0.5μL、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μL，BVDV、BCV和BRV上下游引物各0.75 μL，42℃水浴1h。BVDV、BCV和BRV PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：超純水17μL，10×PCR buffer（Mg2+free）3μL，MgCI24μL，dNTP 2.5μL，Taq酶0.5 μL，BVDV、BCV和BRV上下游引物各0.5μL，BVDV、BCV和BRV cDNA模板各2μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min，（94℃30s、55℃30s、72℃50s）30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。取5μL產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖核酸凝膠電泳，擴(kuò)增片段膠回收，連接于pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒，送華大基因工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

2　結(jié)果

2.1臨床觀察

病牛初期糞便帶有血液和脫落的腸黏膜后期排出水樣血便，體溫升高達(dá)41℃，飲食減退，精神萎靡，消瘦，皮膚彈性降低，尿少且呈深黃色，唾液黏稠呈絲狀，流涎增多，鼻黏膜糜爛或潰瘍，患牛肛門和

陰門沾有血便。初步診斷為感染牛病毒性腹瀉病毒，并可能有細(xì)菌混感。

2.2細(xì)菌分離鑒定

2.2.1分離菌在各種培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況及鏡檢特征 經(jīng)培養(yǎng)分離菌在血瓊脂平板上長(zhǎng)出圓形、邊緣整齊、表面光滑的單個(gè)菌落；接種于MAC的菌落呈粉紅色、圓形、邊緣整齊、表面光滑、無(wú)黏性；在大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)出藍(lán)綠色的小菌落，呈圓形，表面光滑。分離菌革蘭染色鏡檢，顯微鏡下可見(jiàn)革蘭陰性，中等大小直桿菌，兩端鈍圓，成對(duì)或散在排列，無(wú)芽胞，有微莢膜。根據(jù)以上特征，初步確定分離菌為腸桿菌科埃希菌屬的大腸埃希菌。

2.2.2生化試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)分離菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果符合大腸埃希菌的特征。分離細(xì)菌能發(fā)酵棉子糖，鼠李糖，麥芽糖，葡萄糖，甘露醇，發(fā)酵乳糖遲緩，不分解蔗糖；不分解尿素，不利用檸檬酸鹽，可還原硝酸鹽；賴氨酸脫羧酶及尿素酶試驗(yàn)皆呈陰性；吲哚、MR試驗(yàn)陽(yáng)性；VP試驗(yàn)陰性。

2.2.3菌液PCR檢測(cè) PCR擴(kuò)增出預(yù)期1 500bp左右的目的條帶（圖1），將所得到的序列與Gen-Bank中已知的E.coli 16SrRNA序列進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)到99%，鑒定該分離菌為大腸埃希菌。

2.2.4大腸埃希菌血清型鑒定 采用大腸埃希菌“O”抗原分型血清將分離到的大腸埃希菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示，分離株血清型為O8，是引起幼牛腹瀉的常見(jiàn)血清型。

2.2.5大腸埃希菌藥敏試驗(yàn) 運(yùn)用紙片法對(duì)分離純化的大腸埃希菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出該分離菌對(duì)頭孢類藥物及氧氟沙星高度敏感，對(duì)慶大霉素中敏，對(duì)卡那霉素、磺胺甲惡唑、氟哌酸、氧氟沙星低敏，對(duì)林可霉素、氯霉素、利福平、紅霉素、氟苯尼考、青霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素耐藥。

圖1　分離菌的16SrRNA PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of 16SrRNA of isolated bacteria

表2　大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The drug sensitivity test result of E.coil

2.3病毒分離與PCR鑒定

2.3.1病毒細(xì)胞分離培養(yǎng) 糞便上清液接種MDBK單層細(xì)胞，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。對(duì)照組正常，接毒組出現(xiàn)明顯細(xì)胞

病變，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，在-20℃冰箱凍融二次后，再次接種MDBK單層細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳3代，單層細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變。

2.3.2病毒RT-PCR檢測(cè) 對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便上清進(jìn)行BVDV、BRV、BCV三種病毒RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果擴(kuò)增出291bp大小條帶，符合BVDV目的條帶大小，而B(niǎo)RV、BCV檢測(cè)均為陰性（圖2），將PCR產(chǎn)物序列與GenBank中已知的BVDV序列進(jìn)行比對(duì)，與基因2型牛病毒性腹瀉病毒同源性達(dá)到100%，鑒定該病毒分離株為基因2型牛病毒性腹瀉病毒（BVDV-2）。

圖2　細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便上清RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR results of cell cultures and feces

3　討論

通過(guò)臨床檢察和實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌與病毒分離鑒定，初步判定該起犢牛出血性腹瀉病例是由O8型大腸埃希菌和基因2型牛病毒性腹瀉病毒混合感染造成。在國(guó)內(nèi)有已有報(bào)道，牛病毒性腹瀉病毒可引起犢牛出血性腹瀉，O8型大腸埃希菌也可引起牛腹瀉，但是這兩種病原同時(shí)檢測(cè)到尚無(wú)報(bào)道［9-10］。分析病因，可能為犢牛先感染牛病毒性腹瀉病毒導(dǎo)致機(jī)體免疫機(jī)能降低，并繼發(fā)大腸埃希菌感染引起的。要將發(fā)病犢牛及時(shí)隔離，并進(jìn)行相應(yīng)的治療。

牛病毒性腹瀉作為一種重要的動(dòng)物疫病，目前在我國(guó)已普遍存。由于在我國(guó)該病具有特征性臨床癥狀的發(fā)病并不高，各大小養(yǎng)牛場(chǎng)對(duì)該病的防治并不重視，該病又可通過(guò)血液、分泌物與排泄物等多種途徑傳播，感染BVDV的孕牛產(chǎn)下的犢牛對(duì)該病毒有免疫耐受性，可持續(xù)感染BVDV，終身帶毒，持續(xù)排毒，成為重要傳染源，因此長(zhǎng)期以來(lái)該病一直嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展［11-12］。同時(shí)BVDV還是牛源生物制品，如血清、凍精、冷凍胚胎及疫苗等的常在污染源，給畜牧業(yè)和相關(guān)生物制品領(lǐng)域造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。牛病毒性腹瀉致病機(jī)理復(fù)雜，給本病的防治帶來(lái)很大困難［13］。國(guó)外防控牛病毒性腹瀉病毒主要采取檢疫、淘汰牛群中持續(xù)性感染牛和疫苗預(yù)防接種的方法，并取得一定的成效。牛病毒性腹瀉病毒與豬瘟病毒存在血清交叉反應(yīng)性，我國(guó)也曾對(duì)豬瘟弱毒疫苗預(yù)防BVD-MD進(jìn)行過(guò)研究，20世紀(jì)80年代初，西南民族學(xué)院拉稀病課題組曾使用豬瘟疫苗對(duì)四川紅原地區(qū)暴發(fā)的牛病毒性腹瀉的牦牛進(jìn)行過(guò)預(yù)防，實(shí)踐證實(shí)有效。據(jù)悉目前一些地區(qū)仍有使用豬瘟疫苗預(yù)防本?。?4］。

致病性大腸埃希菌是醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)臨床感染中最常見(jiàn)的病原菌之一［15］，血清型眾多，不同血清型之間存在著免疫差異，缺乏相互交叉免疫，同時(shí)大腸埃希菌易產(chǎn)生耐藥性，全國(guó)各地均有分離到較強(qiáng)耐藥性的菌株，為本病的治療帶來(lái)了很大難度。本起病例分離菌經(jīng)血清型鑒定為O8，是引起牛腹瀉的常見(jiàn)致病菌［10］。分離株僅對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢西丁、氧氟沙星4種常見(jiàn)抗菌藥物敏感，而對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐受，這可能是藥物濫用的結(jié)果，為本病的治療帶來(lái)了很大難度。盲目用藥，會(huì)延誤病情，造成新的耐藥菌株，進(jìn)而造成更大的損失。通過(guò)藥物敏感試驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥，不僅可以有效治療大腸埃希菌病，而且可以防止耐藥菌株的產(chǎn)生；針對(duì)大腸埃希菌易產(chǎn)生耐藥性且各菌株缺乏互相交叉免疫保護(hù)的特點(diǎn)，可以用多價(jià)大腸埃希菌苗預(yù)防本?。?6］，至于本次分離到的大腸埃希菌能否成為當(dāng)?shù)氐囊呙缰赀€有待進(jìn)一步的深入研究。

針對(duì)犢牛出血性腹瀉致病原的特點(diǎn)，要做好該病防控工作，應(yīng)重點(diǎn)從下幾個(gè)方面著手：一要嚴(yán)格清掃消毒牛場(chǎng)圈舍和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)，改善衛(wèi)生條件，監(jiān)測(cè)牛場(chǎng)周圍環(huán)境衛(wèi)生、空氣、水資源的質(zhì)量；二要做好養(yǎng)殖場(chǎng)的生物安全防護(hù)，做好滅鼠工作，及時(shí)隔離患病牛，切斷病原體的傳播路徑。

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Isolation and Identification of Pathogens in Hemorrhagic Diarrhea Cases of Calves

ZHU Mei-sheng1，ZHANG Xin-bing2，ZHANG Yi3，XU Shou-zhen1，CAO Zhi-wei1，LI Chao1，LIU Lin-lin1，GUO Yan-yan4，YIN Yan-bo1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong，
266109，Shandong，China；2.Qingdao Blue Cross Animal Hospitol，Qingdao，Shandong，266109，China；
3.China Animal Health and Epidemiology Centre，Qingdao，Shandong，266032，China；4.Qingdao OLand-Better Bioengineering Co.，LTD，Qingdao，Shandong，266101，China）

Abstract：In order to identify the pathogens of hemorrhagic diarrhea of calves in a farm of Shandong province，stool samples of sick calves were collected.Bacteria were isolated and indentified by bacterial culture，Gram staining，biochemical identification and 16SrRNA sequence analysis.Virus was isolated by inoculating the samples in MDBK cell and the nucleotides of the virus were amplified by RT-PCR and sequenced. The results showed that the isolated bacteria are E.coli O8，which had multiple drug resistance.The isolated virus is genotype 2bovine viral diarrhea virus.The disease was initially determined by pathogenic E. coli O8and genotype 2bovine viral diarrhea virus mixed infection.

Key words：calf；hemorrhagic diarrhea；E.coli；Bovine viral diarrhea virus；isolation and identification

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：朱梅勝（1988-），男，山東昌樂(lè)人，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病防控研究。＊

收稿日期：2014-11-12

中圖分類號(hào)：S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0132-05