孫玉倩，李瑞珍，宋高杰，關(guān)佳佳，李曉青，趙俊江，梁瑩瑩，潘耀謙（河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

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特殊染色法對(duì)仔豬先天性黑色素瘤的鑒別

孫玉倩，李瑞珍，宋高杰，關(guān)佳佳，李曉青，趙俊江，梁瑩瑩，潘耀謙＊
（河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

摘 要：為了診斷仔豬原發(fā)性黑色素瘤是良性還是惡性腫瘤，通過(guò)臨床病理學(xué)觀察，病理組織學(xué)的普通染色、特殊染色及脫黑色素等方法，對(duì)兩例仔豬的黑色素瘤進(jìn)行了觀察。臨床檢查，兩例仔豬均為出生后就發(fā)現(xiàn)有腫瘤，并隨著仔豬的生長(zhǎng)而不斷變大。腫瘤呈半球形隆突于體表，表面有不同程度的破潰、出血和結(jié)痂。病理組織學(xué)檢查，腫瘤具有完整的結(jié)締組織包膜，腫瘤組織內(nèi)有大小不等的分葉，在間質(zhì)中浸潤(rùn)較多的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，具有良性腫瘤的特點(diǎn)。而腫瘤細(xì)胞呈多形性，如圓形、梭形、星形或長(zhǎng)條形等；生長(zhǎng)方式又是多樣性，極性紊亂，如旋渦狀、條索狀、結(jié)節(jié)狀、篩狀等；瘤細(xì)胞還可浸潤(rùn)到間質(zhì)等，又具有惡性瘤的特點(diǎn)。此外，腫瘤還可引起皮膚肥厚，汗腺細(xì)胞增生和毛囊萎縮。研究表明，豬先天性黑色素細(xì)胞瘤來(lái)源于皮膚的表皮，它雖然是一種良性腫瘤，但易向惡性腫瘤轉(zhuǎn)化，因?yàn)榱黾?xì)胞的多形性及排列的極性紊亂具有惡性腫瘤的特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：先天性黑色素瘤，病理組織學(xué)，特殊染色

黑色素瘤（melanoma）是由黑色素瘤細(xì)胞和瘤間質(zhì)所構(gòu)成的一種色素性腫瘤［1］。黑色素瘤在人群中發(fā)病率較高，多以惡性形式出現(xiàn)。根據(jù)美國(guó)最新發(fā)布的統(tǒng)計(jì)資料顯示，世界上每年大約有16萬(wàn)人患黑色素瘤［2］。據(jù)報(bào)道在家畜中馬、騾易患惡性黑色素瘤［3］，而犬、豬易患良性黑色素瘤［4-5］，但也有惡性病例的報(bào)道［6-8］。其他動(dòng)物的黑色素瘤報(bào)道較少［9-10］。動(dòng)物的黑色素瘤一般為繼發(fā)性的，而原發(fā)性黑色素瘤的報(bào)道較少。目前，國(guó)外對(duì)黑色素瘤的研究主要集中在發(fā)病機(jī)理方面，即基因突變的研究［11-12］，國(guó)內(nèi)多見(jiàn)于病例的報(bào)道。本文對(duì)兩例仔豬的原發(fā)性黑色素瘤從臨床表現(xiàn)，到眼觀病變，結(jié)合病理組織學(xué)檢查，并通過(guò)VG、Masson、PTAH等特殊染色法和脫黑色素法來(lái)分析良性和惡性黑色素瘤的特點(diǎn)，為獸醫(yī)臨床診斷和鑒別黑色素瘤提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

兩例患先天性黑色素瘤的仔豬均來(lái)自河南科技學(xué)院獸醫(yī)院，通過(guò)手術(shù)的方式，切除了腫瘤，用100 g/L福爾馬林固定后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2方法

1.2.1切片制作 按常規(guī)方法進(jìn)行，即將固定好的腫瘤組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟和包埋后，用Leica切片機(jī)制成5μm厚的切片，并用常規(guī)染色法（HE）染色。

1.2.2特殊染色 為了鑒別腫瘤組織中不同的成分，對(duì)組織切片分別做了汪吉松（VG）、馬松三色（Masson）和磷鎢酸蘇木精（PTAH）染色。各種染色方法和步驟分別按常規(guī)進(jìn)行。

1.2.3脫黑色素 為了鑒別腫瘤細(xì)胞有無(wú)異形性和分裂像，對(duì)腫瘤組織的切片進(jìn)行了脫黑色素處理。其方法是：取數(shù)張切片脫蠟后浸入去離子水，待切片充分水合后放入盛有5g/L高錳酸鉀溶液的立式染色缸，將染色缸放到盛有自來(lái)水的燒杯內(nèi)，用電爐加熱，至燒杯內(nèi)的水沸騰后關(guān)電爐，冷卻至室溫后，取出切片，再用10mg/L草酸漂白3次，每次浸染1min，自來(lái)水洗2min，然后進(jìn)行常規(guī)HE染色。

2　結(jié)果

2.1臨床病理學(xué)觀察

其中一例病豬出生時(shí)肩背部有一顆黃豆粒大小的結(jié)節(jié)，呈淡灰褐色，隨著仔豬的生長(zhǎng)，小結(jié)節(jié)也逐漸長(zhǎng)大。50日齡前來(lái)就診時(shí)，腫瘤呈半球形，直徑約5cm。腫瘤表面潰爛、出血，并有黑褐色結(jié)痂。腫瘤有完整的包膜，與周?chē)M織有較明顯的分界（圖1A）。另一例病豬出生時(shí)在臀部和膝上部各有一個(gè)榛子大小的結(jié)節(jié)，25日齡時(shí)結(jié)節(jié)達(dá)4cm大，呈半球形隆突于體表，表面有輕度的破損與結(jié)痂（圖1B）。手術(shù)切除時(shí)，兩例腫瘤均有較明顯的蒂，有較厚而完整的包膜，

腫瘤的實(shí)質(zhì)呈灰白色并見(jiàn)暗褐色斑塊。手術(shù)切除檢查，腫瘤主要位于真皮和皮下織，并未侵及深部組織（圖1C）。

2.2病理組織學(xué)檢查

2.2.1普通染色觀察 切片經(jīng)HE染色后，在低倍鏡下檢查，黑色素瘤主要位于真皮和皮下組織。由真皮增生的結(jié)締組織伸入腫瘤中，將瘤組織分成形狀和大小不一的小葉樣結(jié)構(gòu)，小葉的間質(zhì)多少不等，寬窄不一，其中浸潤(rùn)有較多的淋巴組織，單核細(xì)胞，也有較多的黑色素瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。真皮內(nèi)的毛囊和皮脂腺萎縮，汗腺的腺腔擴(kuò)張，部分汗腺上皮增生，形成覆層上皮。從黑色素瘤的起源與組織的聯(lián)系觀察，腫瘤主要發(fā)源于表皮基底部，是黑色素細(xì)胞惡變的結(jié)果。在表皮的棘細(xì)胞層和基底層的柱狀細(xì)胞為黑色素瘤的起始部，此處可見(jiàn)大量黑色素瘤細(xì)胞增生（圖2A），與正常的黑色素細(xì)胞相比，胞體較大，形態(tài)不一，含有大量黑色素。大量的黑色素瘤細(xì)胞從表皮延伸到真皮及皮下組織，形成一個(gè)整體。在瘤組織中，黑色素瘤細(xì)胞的大小不一，形態(tài)多樣，有圓形、類(lèi)圓形、梭形、星形或呈平滑肌細(xì)胞樣的長(zhǎng)條形等（圖2B）；瘤細(xì)胞內(nèi)由于含黑色素?cái)?shù)量不同，所以顏色深淺不一，含黑色素少時(shí)，瘤細(xì)胞體積較小，呈淺褐色，細(xì)胞核較清晰；含黑色素多時(shí)，瘤細(xì)胞變大，體積懸殊，呈深褐色甚至是黑色，細(xì)胞核被黑色素掩蓋而看不見(jiàn)。從排列上來(lái)看，腫瘤組織的極性紊亂，排列不整，常見(jiàn)的排列方式有旋渦狀（圖2C）、條索狀、團(tuán)塊狀（圖2D）、小結(jié)狀、篩狀、編織狀或席片狀等。

2.2.2特殊染色觀察 用Masson三色染色時(shí)結(jié)締組織中的膠原纖維被染成綠色，骨骼肌纖維被染成紅色。此時(shí)見(jiàn)瘤組織的外周有厚層綠染的膠原纖維，后者伸入瘤組織，將之分成大小不一的小葉；伸入皮肌中，將肌纖維的連接性破壞，紅色的肌纖維鑲嵌在綠色的膠原纖維間（圖2E）。用PTAH染色時(shí)，皮肌中的骨骼肌纖維變成藍(lán)色，肌纖維染色較深，胞漿呈均質(zhì)狀，橫紋不清。膠原纖維染成磚紅色，與肌纖維明顯區(qū)分。用VG染色時(shí)，膠原纖維呈深粉紅色，而肌纖維染成黃色。此時(shí)見(jiàn)位于腫瘤組織外圍的纖維組織均為紅染的膠原纖維，而無(wú)肌纖維（圖2F）。特殊染色證明，HE染色時(shí)瘤組織中呈條索狀類(lèi)似肌纖維的組織，主要是膠原纖維，而皮肌中的骨骼肌纖維已變性和壞死。存在于腫瘤間質(zhì)中的肌纖維，是腫瘤組織發(fā)生時(shí)，將皮肌破壞而形成的。

2.2.3脫黑色素結(jié)果 黑色素瘤組織的切片經(jīng)過(guò)脫黑色素和用HE染色后，光鏡下見(jiàn)腫瘤細(xì)胞中黑色素完全被脫去，或僅留少量細(xì)顆粒。脫色素后的瘤細(xì)胞大小似乎接近，但其的形態(tài)還是不一致的，有成熟的瘤細(xì)胞，也見(jiàn)幼稚的瘤細(xì)胞，梭形瘤細(xì)胞較多。在瘤組織的部分視野中常見(jiàn)瘤細(xì)胞的分裂像，偶見(jiàn)多極分裂像（圖2G），但在腫瘤細(xì)胞形態(tài)不一和排列紊亂的部位，可見(jiàn)較多的核分裂像（圖2H）。

圖1　豬黑色素瘤的臨床病理學(xué)檢查Fig.1 Clinical pathological examination of melanoma in piglets

3　討論

據(jù)報(bào)道［13-14］，黑色素瘤不論在人或動(dòng)物中，多以惡性為主，所以，一般說(shuō)到黑色素瘤都稱(chēng)為惡性黑色素瘤。實(shí)際上豬的黑色素瘤多以良性為主。本研究雖然只檢查了兩例豬的原發(fā)性黑色素瘤，但從中發(fā)現(xiàn)，不論常規(guī)染色，還是特殊染色，鏡檢時(shí)均可發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞的排列呈多形態(tài)性，排列極性紊亂，有團(tuán)塊狀、分葉狀、條索狀、巢狀等；瘤細(xì)胞的形態(tài)呈多樣，體積懸殊較大，有梭形、圓形、半圓形、類(lèi)圓形、星形，甚至見(jiàn)到瘤巨細(xì)胞。脫黑色素后在瘤組織的不同部位，還可見(jiàn)到多少不一的分裂像。這種瘤細(xì)胞大小不一，排列極性紊亂和較多的分像，多為惡性腫瘤所具有的特點(diǎn)。據(jù)報(bào)道［15］，根據(jù)黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)，一般可將之分為3類(lèi)，即上皮樣細(xì)胞型、小上皮樣細(xì)胞型和梭形細(xì)胞型。瘤細(xì)胞的排列方式，也與細(xì)胞的形態(tài)有密切的關(guān)系，如上皮樣細(xì)胞型主要以巢狀、片狀結(jié)構(gòu)排列，細(xì)胞為圓形，細(xì)胞核明顯，胞漿豐富，體積較大；小上皮樣細(xì)胞型成彌散分布，細(xì)胞為圓形、類(lèi)圓形，深染后細(xì)胞核不明顯，胞漿較少，體積較??；梭形細(xì)胞型主要以束狀、條索狀、旋渦狀結(jié)構(gòu)排列，細(xì)胞以梭形為

主，胞核呈卵圓形，胞漿少。由此可見(jiàn)，良性黑素瘤與惡性黑色素之間，瘤細(xì)胞及其排列方式有較多的共同特點(diǎn)，所以良性黑色素瘤極易向惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)化。

圖2　豬黑色素瘤的病理組織學(xué)檢查Fig.2 Histopathological examination of melanoma in piglet

一些病理組織學(xué)研究表明［1，12，15］，惡性黑色素瘤由于細(xì)胞的分化速度快，細(xì)胞較幼稚，所以形成的黑色素較少，瘤細(xì)胞中的黑色素多呈細(xì)胞顆粒狀，較少形成大塊狀。本研究觀察的2例豬黑色素瘤，成熟的瘤細(xì)胞中均有大量黑色素，有的呈塊狀，充滿細(xì)胞漿，細(xì)胞核完全被黑色素掩蓋，形成瘤巨細(xì)胞樣的黑色素瘤細(xì)胞。腫瘤周?chē)山Y(jié)締組織形成較完整的包膜，結(jié)締組織伸入瘤實(shí)質(zhì)，構(gòu)成瘤間質(zhì)，其中呈然有一些黑色素細(xì)胞浸潤(rùn)，但也有大量的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明本瘤具有良性腫瘤的特征，再加上全身未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，故將之診斷為良性黑色素瘤。

本研究應(yīng)用一些特殊染色方法和脫黑色素方法，對(duì)腫瘤組織中的一些難以辨認(rèn)的成分進(jìn)行了鑒別，對(duì)于確定病性起到了重要作用。通過(guò)PTAH、VG和Masson三色染色，將腫瘤組織中的膠原纖維與肌纖維進(jìn)行了區(qū)分，發(fā)現(xiàn)位于腫瘤包膜內(nèi)來(lái)自于皮肌的肌骼肌纖維發(fā)生變性，橫紋消失，肌漿深染。而位于腫瘤組織內(nèi)的骨骼肌纖維則變性，壞死，斷裂成碎塊狀。這說(shuō)明位于腫瘤組織內(nèi)的骨骼肌纖維是腫瘤從表皮發(fā)生時(shí)浸入皮肌并在其中不斷生長(zhǎng)而形成的。大量結(jié)締組織包裹著腫瘤，但在腫瘤的間質(zhì)內(nèi)均有較多的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。脫去腫瘤細(xì)胞的黑色素后，更有便于觀察瘤細(xì)胞的分裂像，此時(shí)發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織的不同部位，均可見(jiàn)到分裂像，但在瘤細(xì)胞大小不一、排列不整的部位，分裂像較多。本研究通過(guò)對(duì)原發(fā)性黑色素瘤組織和細(xì)胞的形態(tài)觀察，結(jié)合特殊染色的鑒別，發(fā)現(xiàn)豬原發(fā)性黑色素細(xì)胞瘤雖然仍屬良性腫瘤，但它具備一些惡性腫瘤的特點(diǎn)，在一些特定的情況下很易轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒院谏亓觥?/p>

此外，本研究還觀察到腫瘤對(duì)周?chē)M織造成較大的影響，除了腫瘤所在部位的毛囊萎縮，皮脂腺消失和表皮過(guò)度增生肥厚外，還發(fā)現(xiàn)一些汗腺上皮增生，上皮細(xì)胞由一層變成多層，腺細(xì)胞體增大，腺腔變小。這說(shuō)明在黑色素瘤發(fā)育增殖的過(guò)程中，也可以導(dǎo)致周?chē)M織的其他成分發(fā)生增生或瘤變。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 馬學(xué)恩.家畜病理學(xué)［M］.4版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：167.

［2］ Boguslawska J，Malecki M.siRNA preparations in gene therapy of melanoma［J］.Dev Period Med，2013（3）：196-201.

［3］ 盛 精.免疫馬黑色素瘤試驗(yàn)報(bào)告［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1981 （7）：11.

［4］ 朱曉英，齊永新，龔國(guó)華，等.犬食道黑色素瘤的診斷［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2011，47（12）：67.

［5］ 曹憐之.商品豬皮膚黑色素瘤的觀察［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1984 （4）：47-49.

［6］ 劉偉偉，尉立國(guó)，王秋悅，等.犬黑色素瘤的診斷病例［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（5）：54-55.

［7］ 劉成武，楊 敏.犬口腔黑色素瘤的診治［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（24）：108.

［8］ 龔國(guó)華，齊永新，于 濤等.一例犬惡性黑色素瘤的臨床診治［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（12）：180-181.

［9］ 梁玉珍，陳絢姣，蔡勤輝，等.華南虎惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移病例［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2004（12）：52.

［10］ 袁榮茂，景積友.水牛惡性黑色素瘤病例報(bào)告［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，1986（3）：30.

［11］ Bhandaru M，Ardekani G S，Zhang G H，et al.A combination of p300and Braf expression in the diagnosis and prognosis of melanoma［J］.BMC Cancer，2014（14）：398-409.

［12］ Regester K D，Gartner J J，Emmanuel R，et al.A highly recurrent RPS27 5'UTR mutation in melanoma［J］.Oncotarget，2014，5（10）：2912-2917.

［13］ Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistic［J］.CA Cancer J Clin，2013，63（1）：11-30.

［14］ Itoh H，Mukaiyama T，Goto T，et al.Non-surgical treatment of canine oral malignant melanoma：A case study of the application of complementary alternative medicine［J］.Oncol Lett，2014（7）：1829-1830.

［15］ 易恒安.皮膚惡性黑色素瘤臨床病理分析探究［J］.河北醫(yī)學(xué)，2013，19（7）：1078-1080.

Differentiation of Congenital Melanoma in Piglet with Special Staining Methods

SUN Yu-qian，LI Rui-zhen，SONG Gao-jie，GUAN Jia-jia，LI Xiao-qing，ZHAO Jun-jiang，LIANG Ying-ying，PAN Yao-qian
（College of Animal Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang，Henan，453003，China）

Abstract：In order to identify the benign or malignant tumor of the congentital melanoma in piglet，2piglets with congentital melanoma were observed by means of the clinical and pathological observation，conventional staining，special staining and removal melanin method.When two piglets were born，their melanoma was found.The tumors were getting bigger with the growth of piglets.The tumors showed hemispherical protuberance on the skin.There were ulceration，bleeding and scab on the surface of tumors.Histopathologically，the melanoma possessed benign tumor characters，for example，the tumors had a complete connective tissue capsule in its outside，there were irregular leaflets in tumor tissue and more lymphocytes and mononuclear cells infiltrated in mesenchyme.But the melanoma also had malignant tumor characters，for example，the oncocytes were polymorphic，such as rotundity，fusiform and star-like，the growth pattern of tumor tissue also had diversity，such as swirly，cord-like，nodositas，cribriform and so on，the polarity of the tumor cells arrangement was in disorder，the oncocyte also could infiltrate to mesenchyme.In addition，the tumor also caused the dermatauxe，hyperplasia of sweat gland cell and atrophy of hair follicle.This research proved that the congentital melanoma in piglet originated from epidermis of skin.Although the congentital melanoma in piglet is a benign tumor，it is easily to becom malignant tumor.Because the oncocytes have the characters of malignant tumor cells，the oncocytes have polymorphism and the polarity of its arrangement is disorder.

Key words：congentital melanoma；histopathology；special staining

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：孫玉倩（1988-），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。＊

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（132102110118）

收稿日期：2014-08-29

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.35

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0128-04