毛黎紅，王開功＊，周碧君，文　明，程振濤，溫貴蘭，馮旭芳（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽55005；.貴州省生豬質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，貴州開陽550001）

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貴州省部分地區(qū)規(guī)?；i場仔豬4種致豬腹瀉病病毒感染調(diào)查

毛黎紅1，2，王開功1，2＊，周碧君2，文明2，程振濤2，溫貴蘭2，馮旭芳2
（1.貴州大學動物科學學院，貴州貴陽550025；2.貴州省生豬質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，貴州開陽550001）

摘 要：為了解貴州省規(guī)?；i場豬病毒性腹瀉的流行情況，從5個地區(qū)9個規(guī)模化豬場采集的腹瀉仔豬的糞便和病死豬的腸內(nèi)容物及腸系膜淋巴結(jié)共66份，采用PCR或RT-PCR方法，分別進行豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（RV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的核酸檢測。結(jié)果顯示，PEDV、TGEV、RV和PCV-2檢出率分別為72.72%、1.52%、12.12%和3.03%；PEDV/PCV-2、PEDV/RV、PEDV/TGEV混合感染率分別為3.03%、15.2%和1.52%，總混合感染率為19.70%，其中5個豬場為PEDV單獨感染。結(jié)果表明，貴州省部分地區(qū)規(guī)?；i場發(fā)生腹瀉病的主要病原為PEDV，其次是TGEV、RV和PCR-2，且存在混合感染，為貴州省豬病毒性腹瀉的防控提供一定的參考資料。

關(guān)鍵詞：仔豬；豬流行性腹瀉病毒；豬傳染性胃腸炎病毒；豬輪狀病毒；豬圓環(huán)病毒2型

豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的一類疾病，是導致大批豬群死亡的重要原因之一，由于該病傳播迅速，引起豬群腹瀉、嘔吐、脫水。即使豬群耐過存活，但該豬生長緩慢，致使飼料報酬降低，增加養(yǎng)殖成本［1］，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。引起豬病毒性腹瀉的病原有豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬輪狀病毒（Rotarvirus，RV）、豬瘟病毒（Classical swin fever virus，CSFV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）及豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）等，其中以PEDV、TGEV、RV最為常見，同時與其他病毒混合感染［2］，3種病毒對各階段豬群都易感，特別是對哺乳仔豬危害最大，致死率最高。英國于1971年在育肥豬群和架子豬群中首次發(fā)現(xiàn)PED，隨后該病蔓延至歐洲以及亞洲國家，如日本、韓國等都受到高死亡率的威脅。1978年在比利時和英國首次鑒定。我國于1976年首次報道PED的發(fā)生，隨后在26個省、市流行，在2010年10月-2012年初，南方地區(qū)廣泛流行，直至目前仍沒有消減的趨勢。1945年Doyle和Hutchings在美國首次報道TGEV的存在，隨后在歐洲、亞洲等國家廣泛流行。我國于1956年在廣東省首次報道，近年來該病的流行呈明顯的上升趨勢，目前對TGEV進行抗生素等常規(guī)藥物治療無效，主要采取疫苗注射預防。但由于現(xiàn)在不同地區(qū)毒株變異性較強，導致疫苗效果不佳。Woode和Bridge于1974年在英國首次報道了豬輪狀病毒病，隨后在美國、法國、澳大利亞等養(yǎng)豬國家報道大量檢出RV。我國于1982年首次從腹瀉病豬的糞便中首次分離到RV。1990年中國農(nóng)業(yè)科學哈爾濱獸醫(yī)研究所對我國19個省的豬場進行了血清學調(diào)查，結(jié)果顯示豬群均為豬輪狀病毒陽性，并證實RV在我國豬場已普遍存在，并呈上升趨勢［3］。

本試驗通過PCR和RT-PCR方法對貴州省2013年12月-2014年4月采集的66份具有明顯腹瀉癥狀的病料樣本進行檢測，旨在揭示仔豬病毒性腹瀉在貴州省的流行情況以及主要感染病原，為基層獸醫(yī)工作人員制定腹瀉病防控方案提供參考，降低病毒性腹瀉帶來的危害。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 2013年12月-2014年4月，從貴州省5個地區(qū)（貴陽市、黔南州、黔東南州、遵義市和安順市）9個規(guī)?；i場采集腹瀉仔豬的糞便、腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)共計66份，于-80℃保存?zhèn)溆谩CV-2陽性病料于貴州省動物疫病研究室保存；TGEV-PEDV-RV三聯(lián)活疫苗TGEV、PEDV和RV參考株為沈氏動保集團產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑 RNAiso Plus總RNA提取試劑盒、dNTP、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

參考文獻1.2.1引物設(shè)計與合成［7-8］及根據(jù)GenBank中PEDV（登錄號：AF353511）、TGEV（登錄號：DQ811789）、RV（登錄號：AF317123）和PCV-2（登錄號：KJ187306）核酸序列，針對PEDV-COE、TGEV-S、RV-VP7和PCV-2-ORF2基因進行引物設(shè)計，送生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

表1　引物信息Table 1 Primer information

1.2.2病料處理 豬糞便棉拭子樣本用無菌無核酸水液做10倍稀釋，病死仔豬腸系膜淋巴結(jié)研磨后用無菌PBS稀釋，反復凍融2次～3次，8 000r/min離心5min；取上清液，4℃、12 000r/min，再次離心5 min，收集上清液，置-80℃保存。

1.2.3DNA提取及PCR擴增 用DNA提取試劑盒提取總DNA，PCR反應總體系50μL：10×PCR Buffer 5μL，dNTPs 1μL，PCV-2-F1/R1引物各為1.5μL（濃度為10 mmol/L），DNA 2μL，Taq酶1μL，ddH2O 38μL；PCV-2擴增條件為：94℃5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃30s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應結(jié)束后，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.4RNA提取及PCR擴增 按RNAiso Plus 總RNA提取試劑盒操作方法提取病料總RNA，以隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，條件為：70℃水浴10min，冰浴5min后置42℃保溫1h。再以引物PEDV-F1/ R1、TGEV-F1/R1和RV-F1/R1分別進行PCR擴增。PEDV、TGEV、RV的PCR反應總體系50μL：10×PCR buffer 5μL，dNTPs 1μL，上、下游引物各為1.5μL（濃度為10mmol/L），cDNA 2μL，Taq酶1μL，ddH2O 38μL；擴增條件為：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共進行35個循環(huán)；最后72℃10min。PCR反應結(jié)束后，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.5結(jié)果判定與分析 根據(jù)檢測結(jié)果進行統(tǒng)計及分析。

2　結(jié)果

2.1腹瀉病料中病原檢測結(jié)果

應用PCR和RT-PCR方法對收集于貴州省5個地區(qū)的9個規(guī)?；i場具有明顯腹瀉癥狀仔豬的66份病料樣品進行PEDV、TGEV、RV和PCV-2核酸檢測，按不同地區(qū)進行比較（表2），部分陽性病料PCR和RT-PCR檢測電泳圖（圖1～圖4）。PEDV的陽性檢出率最高，其次是RV，TGEV和PCV-2為最低，分別為72.72%、12.12%、1.52%和3.03%。腹瀉的發(fā)病日齡為4日齡～21日齡。疫苗免疫效果較差，免疫與未免疫豬場均有腹瀉發(fā)生。

2.2規(guī)模豬場4種病毒混合感染檢測結(jié)果

應用PCR和RT-PCR方法對貴州省5個地區(qū)的9個規(guī)模化豬場采集66份病料樣品進行4種病毒混合感染檢測，均存在PEDV、RV、TGEV、PCV-2的混合感染樣品總計為13份，總混合感染率為19.70%。其中1個豬場存在PEDV與TGEV混合感染，陽性率為1.52%；2個豬場存在PEDV與PCV-2混合感染；陽性率為3.03%；2個豬場存在PEDV與RV混合感染，陽性率為15.2%，其余豬場均為單一感染（表3）。

表2　病原檢測結(jié)果Table 2 Detection result of pathogen

圖1　部分PEDV陽性PCR結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of PEDV samples

圖2　部分RV陽性PCR結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of RV samples

圖3　部分TGEV陽性PCR結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of TGEV samples

圖4　部分PCV-2陽性PCR結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of PCV-2samples

表3　4種病毒混合感染結(jié)果Table 3 Result of mixed infection with four kinds of viruses

3　討論

本研究對貴州省部分地區(qū)臨床表現(xiàn)的9個規(guī)?；B(yǎng)殖場進行了病原學的流行病學調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2013年12月-2014年4月貴州省發(fā)生豬腹瀉的規(guī)?；B(yǎng)殖場PEDV的檢出率為72.7%，TGEV檢出率為0.02%，RV檢出率為12.12%；PCV-2檢出率為0.02%。說明貴州省仔豬病毒性腹瀉主要病原為PEDV，其次是RV。張坤等［4］對河南、湖北、湖南、江西、廣西等省的豬場調(diào)查也顯示，PEDV的陽性率仍然為最高，而TGEV的陽性率最低；肖博仁［5］對湖南不同地區(qū)發(fā)生腹瀉的養(yǎng)豬場進行PEDV流行病學調(diào)查，其陽性率為65%。秦谷雨等［6］對安徽省37個規(guī)?；B(yǎng)豬場采集腹瀉仔豬糞便和腸斷進行檢測，PEDV陽性率為59.1%、TGEV陽性率為5.4%、RV陽性率為

2.7%。孫振釗等［7］從219份樣品檢測顯示PEDV的陽性率為17.35%，PRV為7.76%和TGEV為0。由此可見，全國引起仔豬腹瀉的主要病原為PEDV。

根據(jù)對貴州省5個地區(qū)9個規(guī)模養(yǎng)殖場進行混合感染調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1個豬場存在PEDV與TGEV混合感染，陽性率為0.02%；1個豬場存在PEDV與PCV-2混合感染；陽性率為0.02%；2個豬場存在PEDV與RV混合感染，陽性率為15.2%。于曉龍［8］對黑龍江省發(fā)病豬場的113份樣品和52份樣品進行病原檢測，結(jié)果顯示TGEV檢出率11.9%，與PEDV混合感染占29.2%。TGEV與RDV混合感染率28.8%。由此可見，在全國各地PEDV普遍存在，一旦感染，傳播迅速，對哺乳仔豬的致死率極高。杜季梅［9］采集了河南省58個不同規(guī)模的豬場181份發(fā)病仔豬的病料，進行了PEDV、TGEV、PoRV、CSFV、PRV病原檢測。PEDV陽性檢出率為71.27%，與TGEV、PoRV、CSFV和PRV的混合感染率分別為2.76%、2.21%、56. 91%和17.13%，與CSFV、PRV的三重混合感染陽性檢出率為17.10%，而與TGEV、PoRV的三重混合感染率僅為0.55%。王元等［10］對新疆部分引起仔豬腹瀉259份臨床病料進行病原核酸進行檢測，檢出PEDV陽性163份，Kubovirus陽性97份，PEDV、Kubovirus混合感染96份。表明仔豬腹瀉發(fā)生不止單一病原感染，常常存在混合感染情況。本試驗通過對2013年12月-2014年4月病毒性腹瀉病原進行調(diào)查，引起貴州省豬病毒性腹瀉流行的病毒以PEDV為主。

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［5］ 肖博仁.湖南地區(qū)豬流行性復學病毒的分子流行病學和血清流行病學調(diào)查［D］.湖南長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2012.

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Investigation on Infections with Four Kinds of Viruses Causing Porcine Diarrhea in Large-scale Pig Farms in Parts of Guizhou Province

MAO Li-hong1，2，WANG Kai-gong1，2，ZHOU Bi-jun2，WEN Ming2，CHENG Zhen-tao2，WEN Gui-lan2，F(xiàn)ENG Xu-fang2
（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou，550025，China；2.The Pig Quality and Safety Pigs Engineering Technology Research Center，Guiyang，Guizhou，550000，China）

Abstract：To understand porcine viral diarrhea prevalence in parts of Guizhou province，feces of piglets with diarrhea and intestinal contents and mesenteric lymph nodes of dead pigs were collected（66samples in total）from nine large-scale pig farms in five regions.By PCR or RT-PCR，those samples were detected for porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），porcine transmissible gastroenteritis virus（TGEV），porcine rotavirus（RV）and porcine circovirus type 2（PCV-2），respectively.The results showed that the detection rate of PEDV，TGEV，RV and PCV-2were 72.72%，1.52%，12.12%and 1.52%；the mixed infection rate of PEDV/PCV-2，PEDV/RV，PEDV/ TGEV were 3.03%，15.2%and 1.52%；the total mixed infection rate was 19.70%，and there were five farms with the single infection of PEDV.The results show that，diarrheas happened in large scaled pig farms in partial areas of Guizhou province mainly resulted from PEDV，and TGEV，RV and PCV-2are also major pathogens.Mixed infection can be found in those areas.Those results provide references for prevention against viral diarrhea in Guizhou province.

Key words：piglet；Porcine epidemic diarrhea virus；Transmissible gastroenteritis virus；Rotarvirus；Porcine circovirus-2

作者簡介：毛黎紅（1989-），女，貴州石阡人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物學與免疫學研究。＊

通訊作者

基金項目：貴州省生豬質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心建設(shè)項目（黔科合農(nóng)C字［2011］4022號）；貴州省重大科技專項（黔科合重大專項字［2011］6021-4號）；貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室培育（黔科合計Z字［2011］4008號）；貴州省農(nóng)業(yè)委員會科技計劃項（2014-01號）

收稿日期：2014-07-28

中圖分類號：S858.28

文獻標識碼：B

文章編號：1007-5038（2015）05-0121-04