鐘植文，黎先偉，陳　珊，高綺靜，劉鎮(zhèn)明，楊傲冰＊（.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州5356；.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州5064）

?

一株鴿新城疫病毒的分離鑒定及F與HN 基因序列分析

鐘植文1，黎先偉1，陳珊1，高綺靜1，劉鎮(zhèn)明2，楊傲冰1＊
（1.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣東廣州511356；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

摘 要：從廣東珠三角地區(qū)某鴿場的發(fā)病鴿群采樣，接種10日齡SPF雞胚后分離到一株病毒，命名為JP株。系列微量血凝和微量血凝抑制試驗結(jié)果表明，新城疫病毒（NDV）陽性。測序結(jié)果顯示，該NDV分離株F蛋白裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，具有強毒株序列特點；F基因分型表明，JP株屬于基因Ⅵ型。Blast結(jié)果顯示，JP株F、HN基因序列均與基因Ⅵ型pi/CH/LGD/110208株同源性最高，均達99%。同源性比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)和HN基因、蛋白都與基因Ⅵ型新城疫毒株同源性較高，分別為92.5%～99%、95.5%～99.1%和90.6%～98.7%、91.9%～99%，而與國內(nèi)常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等同源性較低，分別為83.2%～85.9%、89.2%～91%和79.3%～83.4%、86%～89.5%。分離的JP株屬于基因Ⅵ型，并與國內(nèi)常用疫苗株存在一定的差異。

關(guān)鍵詞：鴿；新城疫病毒；F基因；HN基因；基因Ⅵ型

鴿新城疫俗稱鴿瘟，又稱鴿Ⅰ型副黏病毒病，是由鴿新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床發(fā)病為腸炎、下痢和神經(jīng)癥狀為主要特征，是危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一［1］。該病最早在1977年發(fā)生于中東，現(xiàn)已在世界各地廣泛流行［2］。近年來，我國各地常有鴿新城疫的發(fā)生［3-7］。國內(nèi)外鴿場多用新城疫疫苗如Ⅰ系（Mukteswar）、Ⅱ系（B1）、Ⅳ系（La Sota）等免疫鴿群，在一些鴿場起到一定的預(yù)防作用，但常出現(xiàn)免疫失敗。2013年冬，廣東珠三角地區(qū)某鴿場的鴿群發(fā)病并出現(xiàn)死亡。病鴿精神萎靡，羽毛松亂，下痢，拉黃綠色稀糞，并出現(xiàn)扭頭扭頸等神經(jīng)癥狀。本試驗從發(fā)病鴿群中采樣，經(jīng)病毒的分離、鑒定，確定為新城疫病毒。對分離株的F、HN基因進行序列測定和分析，并與近年來新城疫流行毒株和部分常用疫苗毒株F、HN基因的核苷酸序列、蛋白的氨基酸序列進行同源性比較和分析，旨在從分子水平上了解廣東地區(qū)目前鴿新城疫病毒的毒力特點，為該病的預(yù)防和控制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本 于2013年采自廣東珠三角地區(qū)某鴿場的發(fā)病鴿群中10只有神經(jīng)癥狀的鴿子的肺臟、氣管和大腦等組織器官。

1.1.2實驗動物 10日齡SPF雞胚由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

1.1.3血清和主要試劑 新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），減蛋綜合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV），禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9標準陽性血清，購自廣東省動物防疫監(jiān)督所；MiniBEST Viral RNA Extraction Kit、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、Premix Ex Taq，購自TaKaRa（大連）有限公司。

1.2方法

1.2.1病毒分離和傳代 采取發(fā)病鴿群的肺臟、氣管、腦等內(nèi)臟組織，將病料置于研磨器內(nèi)，用含雙抗（青霉素、鏈霉素各6 000U/mL）的生理鹽水充分研磨，反復(fù)凍融3次，4 000r/min離心10min，吸取上清液，4℃作用2h，再經(jīng)細菌濾器過濾除菌，保留濾液。濾液經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚8只，0.2 mL/只，接種后置37℃溫箱孵化，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，以后每天照胚3次，將死亡雞胚置于4℃冰箱過夜，至第96h將全部雞胚置于4℃過夜。觀察死亡雞胚病變，收獲死亡雞胚和凍死雞胚尿囊液，并進行無菌檢查，然后連續(xù)傳代。

1.2.2血凝試驗和血凝抑制試驗 參照文獻［8］，配制10mL/L雞紅細胞懸液，取分離株雞胚尿囊液

進行微量血凝試驗；然后具有血凝活性的雞胚尿囊液分別與新城疫病毒、減蛋綜合征病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標準陽性血清進行微量血凝抑制試驗。

1.2.3基因型鑒定

1.2.3.1引物設(shè)計 根據(jù)該毒株的初步試驗結(jié)果，從GenBank上獲取多株NDV基因序列分析比較后，使用DNA Star（Verison7.1）和Primer Premier（Verison 5.0）針對F和HN基因核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計了2對特異性引物，用于擴增包含F(xiàn)、HN基因的核苷酸片段，所設(shè)計引物送上海英駿生物有限公司按照PAGE級別合成。F1：ACCAAACAGAGAATCCGTGAG，F(xiàn)2：CTTTAGCTCGGCAGCCATATCCTC，預(yù)期擴增1 993bp；HN1：TGAGCACATCATTCTGGAGACTTG，HN2：TGGACGATTTATTGCTAAGCTTG，預(yù)期擴增2 265bp。

1.2.3.2RT-PCR反應(yīng) 用TaKaRa MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取分離株雞胚尿囊液的病毒總RNA，用隨機引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，再用針對新城疫病毒F和HN基因所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增檢測，將RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果。

1.2.3.3序列測定和分析 擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行序列測定，將測得的序列提交NCBI Blast SERVER進行聯(lián)機檢索。應(yīng)用DNA Star（Version 7.1）軟件分析其F蛋白裂解位點的氨基酸序列，并利用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹并確定基因型。從GenBank上獲得B1、La Sota、Mukteswar、F48E9等不同基因型代表株的F、HN基因和氨基酸序列，結(jié)合本試驗分離株的相應(yīng)序列，利用DNA Star（Version7.1）軟件包中的Meg Align軟件進行同源性分析。

2　結(jié)果

2.1病毒分離和傳代

經(jīng)處理的病料接種10日齡SPF雞胚，孵化68h開始出現(xiàn)死亡，死亡胚體全身出血，尤其是頭、頸、腳出血明顯（圖1）。收獲雞胚尿囊液，無菌檢查為陰性。

2.2血凝試驗和血凝抑制試驗

分離株的雞胚尿囊液能凝集雞紅細胞血凝（HA）效價為7孔～8孔。而新城疫病毒、減蛋綜合征病毒和禽流感病毒H5亞型、H7亞型、H9亞型的標準陽性血清對分離株的血凝抑制（HI）效價分別為9孔、0孔、0孔、0孔、0孔，證明分離到的病毒株為新城疫病毒，命名為NDV/PIGEON/JM/2013（簡稱為JP）。

2.3RT-PCR擴增結(jié)果

利用特異性引物對JP株的RNA進行RT-PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得與預(yù)期大小一致的目的片段（圖2）。

2.4F、HN基因序列的測定及遺傳進化分析

將測得的F、HN基因序列經(jīng)NCBI Blast Server檢索，均與GenBank上的Pigeon paramyxovirus 1 strain pi/CH/LGD/110208株（登錄號：JX486550）的核苷酸序列同源性最高，均達到99%。利用DNA Star（Version 7.1）軟件對JP株的F基因序列進行分析，F(xiàn)基因由1 792個核苷酸組成，含有一個長度為1 662個核苷酸的完整ORF，編碼553個氨基酸，含有6個潛在的糖基化位點（85NRT、191NNT、366NTS、447NIS、471NNS和541NNT），以及13個半胱氨酸殘基（25、27、76、199、338、347、362、370、394、399、401、424和523位），其中位于27、76、199、347和401位的半胱氨酸殘基對F1、F2兩個亞單位的連接比較重要。多數(shù)半胱氨酸殘基集中在338-424aa之間，靠近C端的半胱氨酸殘基的保守性對F蛋白的結(jié)構(gòu)框架的維持具有一定意義。此外，F(xiàn)0裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K-RF117，有多個堿性氨基酸的插入，具有新城疫病毒強毒的典型分子特征?；贘P株與GenBank中的不同基因型代表株的F基因47-421共375bp核苷酸序列，利用MEGA6.0軟件分別繪制系統(tǒng)進化樹（圖3，圓形符號為分離株；三角符號為常用疫苗株）。遺傳分析結(jié)果表明，JP株屬于基因Ⅵ型，與pi/CH/ LGD/110208株（登錄號：JX486550）的親緣關(guān)系最近，而與IT-227/82株（登錄號：AJ880277）、2736/00株（登錄號：AY562989）、ASTR/74株（登錄號：Y19012）、GB 1168/84株（登錄號：AF109885）、CH-1/95株（登錄號：AF001132）、Q-GB 506/97株（登錄號：AF109887）等基因Ⅵ型新城疫病毒處于同一進化分支。

利用DNAStar（Version 7.1）軟件對JP株的HN基因序列進行分析，HN基因由2 002個核苷酸組成，含有一個長度為1 716個核苷酸的ORF，預(yù)計編碼571個氨基酸。根據(jù)HN的氨基酸同源性，新城疫病毒可分為A、B、C 3個群，分別為616、577和571個氨基酸。一般來說A群為弱毒，B群中弱毒株、中毒株、強毒株皆有，C群為強毒。按此判斷，JP株屬于C群，為新城疫病毒強毒株。

2.5F、HN基因和蛋白序列同源性分析

利用DNA Star（Version 7.1）軟件包中的Meg

Align軟件對JP株F和HN基因核苷酸、蛋白氨基酸序列與GenBank上獲得毒株的相應(yīng)序列進行同源性比較。結(jié)果表明，JP株F基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列與pi/CH/LGD/110208株等基因Ⅵ型的新城疫毒株同源性較高，分別為92.5%～99% 和95.5%～99.1%，而與國內(nèi)常用疫苗株及其效檢株B1、La Sota、Mukteswar、F48E9等相對序列同源性較低，分別為83.2%～85.9%和89.2%～91%（圖4）。JP株HN基因核苷酸序列、蛋白氨基酸序列與pi/CH/LGD/110208株等基因Ⅵ型的新城疫毒株同源性較高，分別為90.6%～98.7%和91.9% ～99%，而與國內(nèi)常用疫苗株B1、La Sota、Mukteswar等相對序列同源性較低，分別為79.3%～83.4%和86%～89.5%（圖5）。由此可見，分離的JP株與國內(nèi)常用疫苗株及其效檢株存在了一定的差異。

圖1　接種JP株后的SPF雞胚情況Fig.1 SPF chicken embryos inoculated with JP strains

圖2　分離株F和HN基因的RT-PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 RT-PCR products of F gene and HN gene of the isolate

圖3　分離株的F基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogeny tree of F gene of the isolate

圖4　分離株與參考毒株F基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較Fig.4 Comparison on homology of the deduced amino acid sequences of F gene of the isolate and reference strains

圖5　分離株與參考毒株HN基因推導(dǎo)氨基酸序列同源性比較Fig.5 Comparison on homology of the deduced amino acid sequences of HN gene of the isolate and reference strains

3　討論

本次分離的鴿源新城疫病毒JP株的F蛋白裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，具備新城疫病毒強毒株的特征。參照文獻［9］，基于F基因47-421共375bp的核苷酸序列進行基因分型，JP株屬于基因Ⅵ型的新城疫病毒。

目前認為，鴿新城疫起源于雞新城疫，是雞新城疫病毒長期適應(yīng)鴿體內(nèi)環(huán)境并在鴿體內(nèi)發(fā)生變異所導(dǎo)致的。鴿新城疫病毒的生物學(xué)特性不一定與其F蛋白裂解位點的氨基酸序列表現(xiàn)一致，也就是F蛋白裂解位點的特征性結(jié)構(gòu)不完全決定鴿新城疫的毒力。本試驗分離的JP株F蛋白裂解位點為112RR-Q-K-R-F117，HN蛋白含有571個氨基酸，具有強毒株的分子特征，但是否強毒株還應(yīng)進行相應(yīng)的生物學(xué)特性試驗和動物試驗給予確定［10-11］。

目前，國內(nèi)應(yīng)用的新城疫疫苗株主要有B1、La Sota、Mukteswar等，均屬于基因Ⅱ型和基因Ⅲ型，而用于疫苗效力檢驗的北京強毒株F48E9屬于基因Ⅸ型，但當今國內(nèi)鴿群中流行的新城疫毒株中基因Ⅵ型占多［12-14］。不同基因型的毒株進行核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分析顯示，不同基因型之間序列同源性較低，差異較大，相同基因型之間序列同源性較高，差異較小。由此可見，目前疫苗株與鴿群流行株之間已經(jīng)有較明顯的核苷酸、氨基

酸序列以及抗原性差異，當前使用的疫苗株不一定能夠提供100%的完全保護［15-16］。

鴿新城疫的防制，不能單靠疫苗免疫預(yù)防，要結(jié)合隔離、消毒等生物安全措施來綜合防治。鴿子對Ⅰ系（Mukteswar株）中強毒活苗較敏感，對普通油苗佐劑反應(yīng)又較大，因此單靠Ⅳ系（La Sota株）弱毒活苗，難以提供長久有效的保護，宜結(jié)合應(yīng)用有效的鴿群專用（含有基因Ⅵ型毒株）的優(yōu)質(zhì)滅活苗進行適當補免，這有可能減少非典型新城疫的發(fā)生，或者降低其危害。

參考文獻：

［1］ Saif Y M.禽病學(xué)［M］.12版.蘇敬良，高 福，索 勛，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：65-92.

［2］ Kommers G D，King D C，Seal B S，et al.Pathogenesis of six pigeon origin isolates of Newcastle disease virus for domestic chickens［J］.Vet Pathol，2002，39：353-362.

［3］ 蔡紹鑫，焦培榮，高詩敏，等.一株鴿源新城疫病毒的分離鑒定［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（5）：23-25.

［4］ 仇微紅，葉賀佳，李 敏，等.1株鴿新城疫病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2012（3）：7-10.

［5］ 何 琴，焦培榮，劉大偉，等.一株鴿新城疫病毒的分離鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（7）：118-119.

［6］ 趙明秋，胡永明，許麗娜，等.一株鴿新城疫病毒的分離鑒定［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2011，36（3）：36-38.

［7］ 楊麗云，阮二壘，陳芳艷，等.一株肉鴿新城疫強毒的分離鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（4）：201-204.

［8］ GB/T 16550-2008，新城疫診斷技術(shù)［S］.

［9］ Aldous E W，Mynn J K，Banks J，et al.A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1（Newcastle disease virus）isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene［J］.Avi Pathol，2003 June，32（3）：239-257.

［10］ 陳鐘鳴，劉懷然，孫敏華，等.鴿Ⅰ型副黏病毒的分離鑒定及其F基因與HN基因的序列分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30 （9）：1167-1172.

［11］ 范建華，劉華雷，劉學(xué)賢，等.一株鴿新城疫病毒的分離鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011，27（6）：54-56.

［12］ 劉華雷，王志亮，吳延功，等.2002-2007年355株中國新城疫病毒分子流行病學(xué)分析［A］.//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集［C］，2008：135.

［13］ 孫敏華，胡奇林.新城疫病毒分子流行病學(xué)研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（12）：95-99.

文獻綜述

［14］ 吳延功，丁國義，宋翠平，等.新城疫的流行特點與防控措施［J］.中國家禽，2012，34（5）：5-7.

［15］ 何 琴，焦培榮，劉大偉，等.一株廣東鴿新城疫病毒的生物學(xué)特性分析［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2011，32（9）：23-26.

［16］ 劉萬華，王晶鈺，武 寧，等.雞新城疫病毒的分離鑒定與交叉免疫保護試驗［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2013，34（3）：62-67.

Isolation，Identification and Sequence Analyses of F and HN Genes of One Newcastle Disease Virus Strain in Pigeons

ZHONG Zhi-wen1，LI Xian-wei1，CHEN Shan1，GAO Qi-jing1，LIU Zhen-ming2，YANG Ao-bing1
（1.Guangdong Win-sun Bio-pharmaceutical Co.，Ltd，Guangzhou，Guangdong，511356，China；
2.College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

Abstract：Some sick pigeons were sampled from pigeon farm in Pearl River Delta region，and used to inoculate 10day-old SPF chicken embryos，and a virus strain named JP was isolated.The positive result of Newcastle disease virus was determined by HA and HI tests.The result of sequence analysis showed that the amino-acid sequence of the fusion protein cleavage site was 112R-R-Q-K-R-F117，a typical sequence of virulent strains.Genetic analysis showed that the isolate belonged to genotypeⅥ.The result of Blast showed that the sequences of F and HN genes of the isolate have the highest identities with the genotype ⅥNDV（pi/CH/LGD/110208），both with 99%.The homology analyses of F and HN genes and proteins showed that the isolate were high identities with the genotypeⅥNDV，with 92.5%-99%，95.5%-99.1% and 90.6%-98.7%，91.9%-99%，respectively，but low identities with the common vaccine strains，such as B1，Mukteswar and La Sota，only with 83.2%-85.9%，89.2%-91%and 79.3%-83.4%，86%-89.5%，respectively，the isolate differs from the common vaccine strains.

Key words：pigeon；Newcastle disease；F gene；HN gene；genotypeⅥ

通訊作者

作者簡介：鐘植文（1980-），男，廣東臺山人，碩士，主要從事家禽家畜傳染病研究。＊

收稿日期：2014-09-12

中圖分類號：S852.659.5

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0087-05