陽(yáng)愛國(guó)，周　煜，郭　莉，董國(guó)棟，鄧永強(qiáng)，侯　巍，吳云飛，田慧云，馬　坤，陳　冬，文　豪，朱銀寶（.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都600；.湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢0000；.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明600；.四川省廣漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川德陽(yáng)68000；.南京路寶生物科技有限公司，江蘇南京0000）

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牛羊日本血吸蟲抗體檢測(cè)試紙條的研制

陽(yáng)愛國(guó)1，周煜2，郭莉1，董國(guó)棟3，鄧永強(qiáng)1，侯巍1，吳云飛4，田慧云2，馬坤3，陳冬1，文豪1，朱銀寶5
（1.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都610041；2.湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖北武漢430000；3.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明650051；4.四川省廣漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川德陽(yáng)618000；5.南京路寶生物科技有限公司，江蘇南京210000）

摘 要：為研制一種快速檢測(cè)牛羊血吸蟲抗體的試紙條檢測(cè)方法，以乳膠微球標(biāo)記兔抗牛羊IgG為免疫探針，血吸蟲蟲卵可溶性抗原為檢測(cè)線，羊抗兔IgG為質(zhì)控線，建立了快速檢測(cè)牛羊血吸蟲抗體的試紙條檢測(cè)法。該方法可測(cè)出人工感染血吸蟲尾蚴28d及以上的牛血紙抗體，檢測(cè)東畢吸蟲、肝片吸蟲血樣未見交叉反應(yīng)；用試紙條檢測(cè)人工接種血吸蟲牛血紙20份、非疫區(qū)牛血紙30份，與Dot-ELISA法、糞孵法的陽(yáng)性符合率和陰性符合率均為100%。血吸蟲抗體檢測(cè)試紙條在2℃～8℃保存14個(gè)月，室溫保存8個(gè)月不失效。試驗(yàn)表明，血吸蟲病血紙抗體檢測(cè)試紙條具有很高的敏感性、特異性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，適合于基層單位進(jìn)行家畜血吸蟲抗體的快速診斷、普查和檢疫。

關(guān)鍵詞：抗體檢測(cè)試紙條；血吸蟲??；家畜；快速診斷

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全的人畜共患寄生蟲病，主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲。人體血吸蟲主要有6種，分布于全球78個(gè)國(guó)家和地區(qū)［1］，對(duì)人體影響較大的血吸蟲主要有日本血吸蟲

（S.japonicum）、曼氏血吸蟲（S.mansoni）和埃及血吸蟲（S.haematobium），我國(guó)目前僅有日本血吸蟲流行［2］。日本血吸蟲嚴(yán)重威脅著疫區(qū)人民的身體健康和生命安全，同時(shí)也給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失［3］。現(xiàn)在基層單位家畜血吸蟲病的主要診斷方法是間接血凝試驗(yàn)（indirect haemagglutination assays，IHA）［4］和糞孵毛蚴法，前一方法抗原用量大、用時(shí)長(zhǎng)，重復(fù)性與穩(wěn)定性較差；后者需投入大量的人、財(cái)、物，易漏檢且效率低，延誤查治時(shí)機(jī)，這些方法已不能適應(yīng)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確診斷的要求。

雖然近年來(lái)在診斷家畜血吸蟲病的方法中出現(xiàn)了一種快速檢測(cè)方法——雙夾心金標(biāo)免疫滲濾法（DIGFA），但由于該膠體金標(biāo)記的抗原（或抗體）不穩(wěn)定，保存期只有6個(gè)月，并且檢測(cè)結(jié)果受NC膜質(zhì)量和批次的影響較大，加上反應(yīng)板體積大，試劑為液體，不能通過航空和鐵路運(yùn)輸?shù)仍颍?］。血防人員迫切希望有一種更快速簡(jiǎn)便、敏感性高、特異性強(qiáng)、保存期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、易于標(biāo)準(zhǔn)化的診斷新技術(shù)，以提高血吸蟲病的監(jiān)測(cè)監(jiān)控水平。

本試驗(yàn)的抗體檢測(cè)試紙條根據(jù)乳膠微球免疫層析法（DLIA）原理研制，該方法是近年來(lái)從膠體金免疫層析法（GICA）基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，它用紅色乳膠微球代替膠體金作為標(biāo)記物。乳膠是工業(yè)化生產(chǎn)的高分子微球，顆粒大小均一，在液體中形成穩(wěn)定的乳液體系，乳膠微球與膠體金相比，顆粒較大（200nm～300nm），用它作為顯色示蹤物可節(jié)省抗體或抗原用量；乳膠微球經(jīng)羧基化后，可與兔抗牛羊IgG的氨基共價(jià)結(jié)合，形成的乳膠微球-兔抗牛羊IgG結(jié)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，較好地克服了膠體金標(biāo)記物不夠穩(wěn)定的缺點(diǎn)。本試驗(yàn)利用乳膠微球標(biāo)記兔抗牛羊IgG為免疫探針制備牛羊血吸蟲病血紙抗體檢測(cè)試紙條，并進(jìn)行了敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和操作性等研究，為該試紙條的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

乳膠微球、NHS、MES、DEC?HCl、硼砂、硼酸、BSA、KH2PO4、Na2HPO4、蔗糖等試劑及聚酯膜、玻璃纖維、硝酸纖維素膜等耗材全部采用SIGMA公司、Pall公司等進(jìn)口產(chǎn)品；HCl、NaOH等試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；吸水紙，PVC板、上不粘膠、下不粘膠等購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；血吸蟲蟲卵可溶性抗原，自制；兔抗牛羊IgG，自制。

1.2方法

1.2.1血紙及血清的制備

1.2.1.1血吸蟲陽(yáng)性血清及血紙的制備 ①人工接種牛血吸蟲陽(yáng)性血清及血紙的制備。選非疫區(qū)健康牛10頭，經(jīng)糞孵及Dot-ELISA檢查血吸蟲均為陰性，每頭牛人工接種血吸蟲尾蚴1 000條，接種前采血清及血紙，接種后第3周開始采血，以后每周采血一次直至第7周，分別制備血清及血紙各50份，置于-20℃保存?zhèn)溆?。②人工接種羊血吸蟲陽(yáng)性血清及血紙的制備。選非疫區(qū)健康羊5只，經(jīng)糞孵及Dot-ELISA檢查血吸蟲均為陰性，每只羊人工接種血吸蟲尾蚴300條，接種前采血清及血紙，第3周開始采血，以后每周采血一次直至第7周，分別制備血清及血紙各25份，置于-20℃保存?zhèn)溆?。③自然感染血吸蟲病牛陽(yáng)性血紙的制備。選擇湖北、四川、云南血吸蟲病疫區(qū)經(jīng)糞孵確診為血吸蟲病陽(yáng)性牛，按常規(guī)制備血紙，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2血吸蟲陰性血清及血紙的制備 選血吸蟲病非疫區(qū)健康牛羊各10頭（只），經(jīng)糞孵無(wú)血吸蟲毛蚴，Dot-ELISA檢測(cè)為陰性，分別采血制備血清及血紙，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2血吸蟲蟲卵可溶性抗原的制備

1.2.2.1血吸蟲蟲卵的獲取 挑選體重2.5kg新西蘭兔10只，腹部剃毛，用接種環(huán)挑取液面尾蚴，置載玻片上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)尾蚴，然后將有尾蚴的蓋玻片貼于兔腹部皮膚暴露處感染5min～15min，每只兔接種2 000條尾蚴。接種45d后取出兔肝臟，除去膽囊、膽管及結(jié)締組織，用4℃預(yù)冷的10g/L NaCl洗去血污，將肝臟剪成碎塊，以8 000r/min搗碎，每次搗2min，停2min直至完全搗碎均勻。搗碎的肝臟加適量10g/L NaCl稀釋，用60、80、100 和120目篩過濾，濾液再經(jīng)260孔尼龍網(wǎng)過濾，用10g/L NaCl沖洗并收集尼龍網(wǎng)上的蟲卵，然后以3 500r/min離心1min，棄去上、中層，下層金黃色蟲卵反復(fù)用10g/L NaCl洗滌，離心，獲得純凈的血吸蟲卵，蟲卵進(jìn)行凍干保存。

1.2.2.2可溶性抗原的提取 取凍干的血吸蟲卵，用玻璃勻漿器研磨30min，再加少量8.5g/L NaCl研磨30min，然后配成40mL/L懸液，置4℃冰箱浸泡2d，-20℃反復(fù)凍融8次，超聲裂解30min （400W），將裂解液以9 000r/min離心50min，取上清即為血吸蟲蟲卵可溶性抗原。

1.2.3檢測(cè)試紙條的制備

1.2.3.1檢測(cè)線和質(zhì)控線的制備 將硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板的中間部位，將血吸蟲卵可溶性

抗原蛋白稀釋成4mg/mL，在硝酸纖維素膜上制作檢測(cè)線（T線）；將羊抗兔IgG蛋白稀釋成0.2 mg/mL，在硝酸纖維素膜上制作質(zhì)控線（C線）。

1.2.3.2乳膠微球標(biāo)記兔抗牛羊IgG免疫探針干片的制備 ①兔抗牛羊IgG-乳膠微球結(jié)合物的制備。羧基活化的紅色乳膠微球（以下簡(jiǎn)稱乳膠微球）對(duì)pH8.2 0.1mol/L硼酸緩沖液稀釋的兔抗牛羊IgG進(jìn)行標(biāo)記，然后用200mL/L的BSA封閉，然后以13 000r/min離心30min，用Tris-HCl緩沖液將牛血清白蛋白稀釋成5mL/L的封閉液將沉淀重懸，超聲波勻質(zhì)后制成兔抗牛羊IgG-乳膠微球結(jié)合物。②免疫探針干片制備。將兔抗牛羊IgG-乳膠微球結(jié)合物以3.5μL/cm的流速噴涂于聚酯膜上，37℃烘干，制成免疫探針干片。

1.2.3.3試紙條的組裝 將樣品墊、兔抗牛羊IgG-乳膠微球結(jié)合物免疫探針干片、劃有T和C線的硝酸纖維素膜（以下簡(jiǎn)稱層析膜）及吸水紙組裝在PVC板上組裝成大卡，用切條機(jī)切成0.3cm×7.5 cm規(guī)格的試紙條；用鋁箔袋將試紙條以50份/袋進(jìn)行包裝并封口。

1.2.3.4檢測(cè)操作方法 ①操作前準(zhǔn)備。試紙條從冰箱取出置室溫平衡1h；②操作步驟。裁剪血紙圓片0.24cm2放在0.4mL血紙浸泡液中，室溫浸泡30min；取試紙條，將帶箭頭端的試紙條插入已搖勻浸泡好的血紙液中（圖1），待液體在NC膜上滲出0.5cm左右時(shí)，將試紙條平放在盤中或桌面上，5min～30min內(nèi)觀察結(jié)果；③結(jié)果判定。T、C線均出現(xiàn)紅色帶，判為陽(yáng)性；僅C線出現(xiàn)紅色帶，則判為陰性；T、C線均不出現(xiàn)紅色帶，判為無(wú)效（圖2）。

圖1　試紙條浸入樣品液Fig.1 The strip immerged into sample solution

1.2.4試紙條檢測(cè)條件篩選

1.2.4.1最佳血紙浸泡液pH的選擇 取人工接種血吸蟲陽(yáng)性牛血紙10份、羊血紙5份血紙及健康牛血紙10份、羊血紙5份，各自裁取0.24cm2面積血紙片4片，分別用pH6.4、pH6.8、pH7.2和pH7.6的0.1mol/L PBS血紙浸泡液（以下簡(jiǎn)稱血紙浸泡液）0.4mL室溫浸泡30min后，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，篩選最佳pH的血紙浸泡液。

圖2　結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Fig.2 The determination standard of results

1.2.4.2最佳血紙使用面積的選擇 取人工接種血吸蟲牛羊血紙與健康（陰性）牛羊血紙各5份，分別裁取0.12、0.24、0.36cm2的血紙用0.4 mL pH6.8 0.1mol/L的PBS浸泡液室溫浸泡30min，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，篩選最佳血紙使用面積。

1.2.4.3最佳血清稀釋液pH的選擇 分別使用pH6.8、pH7.2和pH7.6 0.1mol/L PBS稀釋液對(duì)人工接種血吸蟲陽(yáng)性牛血清及健康牛血清各10份作1∶1（2倍）稀釋，使用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，篩選最佳pH血清稀釋液。

1.2.4.4最佳血清稀釋倍數(shù)的選擇 使用pH7.2 0.1mol/L的PBS稀釋液對(duì)人工接種42d和49d的陽(yáng)性牛血清及健康牛血清各10份分別作1∶1、1∶2和1∶3倍稀釋，使用試紙條檢測(cè)，篩選血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.4.5試紙條最佳平衡時(shí)間的選擇 將試紙條從4℃～8℃冰箱取出置室溫（15℃～32℃）進(jìn)行平衡，每隔20min檢測(cè)10份牛羊血吸蟲陽(yáng)性血紙及10份健康牛血紙，篩選試紙條在室溫的最佳平衡時(shí)間。

1.2.5試紙條檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)

1.2.5.1敏感性試驗(yàn) 用試紙條檢測(cè)人工接種血吸蟲尾蚴1 000條0、21、28、35、42、49d的10頭牛血紙，考察試紙條可檢測(cè)出人工接種牛血吸蟲抗體的最早時(shí)間。

1.2.5.2特異性試驗(yàn) 用試紙條分別檢測(cè)人工接種血吸蟲牛、羊陽(yáng)性血紙各10份，自然感染東畢吸蟲和肝片吸蟲的牛陽(yáng)性血紙各5份，考察試紙條對(duì)與血吸蟲有親緣關(guān)系的寄生蟲是否有交叉反應(yīng)。

1.2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 用5批次試紙條分別檢測(cè)人工接種血吸蟲尾蚴0、35、42、49d的5頭牛血清及血紙，比較不同批次的檢測(cè)結(jié)果，考察試紙條的可重復(fù)性。

1.2.5.4符合率試驗(yàn) ①血紙與血清的陰、陽(yáng)性符合率的比較。人工接種血吸蟲牛血清和血紙各8份

及羊血清和血紙各5份，自然感染糞孵確診血吸蟲病牛血清和血紙各20份及羊血清和血紙各10份，非血吸蟲病疫區(qū)牛羊陰性血清和血紙各50份，用pH6.8 0.1mol/L PBS 0.4mL浸泡0.24cm2血紙30min，用pH7.2 0.1mol/L PBS對(duì)血清進(jìn)行2倍稀釋，比較試紙條在血紙與血清之間的陰、陽(yáng)性符合率。②試紙條與Dot-ELISA法的符合率比較。用試紙條和Dot-ELISA法分別檢測(cè)人工接種血吸蟲牛陽(yáng)性血紙20份及非疫區(qū)健康牛血紙15份，比較試紙條與Dot-ELISA法的符合率。③試紙條與糞孵血吸蟲法的符合率比較。用試紙條檢測(cè)糞孵確診為感染血吸蟲病牛陽(yáng)性血紙15份，比較試紙條與糞孵血吸蟲法的符合率。

1.2.5.5保存期試驗(yàn) 將試紙條分別置室溫（10℃～34℃）及2℃～8℃保存，每隔2個(gè)月取出室溫和2℃～8℃保存的試紙條分別測(cè)定血吸蟲病陽(yáng)性牛血紙及陰性牛血紙各15份，觀察不同保存條件下試紙條可正確判定陰陽(yáng)性血紙的最長(zhǎng)保存時(shí)間。

2　結(jié)果

2.1試紙條檢測(cè)條件篩選

2.1.1最佳血紙浸泡液pH的選擇 試驗(yàn)結(jié)果顯示，用pH6.4 0.1mol/L PBS浸泡液雖能檢出人工接種血吸蟲牛羊血紙抗體陽(yáng)性率達(dá)100%，但對(duì)健康牛羊血紙檢測(cè)假陽(yáng)性率達(dá)20%；當(dāng)用pH6.8 0.1 mol/L PBS浸泡液浸泡人工接種血吸蟲牛羊血紙及健康牛羊血紙時(shí)，其陰、陽(yáng)性檢出率均達(dá)100%；而用pH7.2和pH7.6 0.1mol/L PBS浸泡液浸泡，雖然健康牛、羊的陰性檢出率均為100%，但檢測(cè)人工接種血吸蟲牛血紙的陽(yáng)性檢出率分別為90%和70%，羊血紙的陽(yáng)性檢出率分別為100%和80%。因此，以pH6.8 0.1mol/L PBS浸泡液為最佳pH血紙浸泡液（表1）。

2.1.2最佳血紙使用面積的確定 試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)血紙使用面積為0.12cm2時(shí)，健康牛羊的血紙的陰性率雖然均為100%，但人工接種血吸蟲的牛羊血紙的陽(yáng)性率均只有60%；當(dāng)血紙面積使用0.24 cm2時(shí)，健康牛羊和人工接種血吸蟲的陰、陽(yáng)性檢出率均分別為100%；當(dāng)血紙面積用0.36cm2，雖然陽(yáng)性檢出率為100%，但陰性血紙的假陽(yáng)性率亦達(dá)20%。所以選擇0.24cm2為血紙的最佳使用面積（表2）。

表1　使用不同pH血紙浸泡液的檢測(cè)結(jié)果Table 1 The test results of blood paper soaked in different pH buffer

表2　血紙不同使用面積的檢測(cè)結(jié)果Table 2 The test results of blood paper in different area

2.1.3最佳血清稀釋液pH的選擇 試驗(yàn)結(jié)果顯示，用pH6.8 0.1mol/L PBS對(duì)血清進(jìn)行稀釋，雖然陽(yáng)性檢出率達(dá)100%，但陰性血清的假陽(yáng)性率達(dá)10%；使用pH7.2 0.1mol/L PBS進(jìn)行稀釋，其陰、陽(yáng)性檢出率均為100%（10/10）；但用pH7.6 0.1 mol/L PBS稀釋的血清，雖然健康牛血清檢測(cè)的陰性率為100%，但人工接種血吸蟲的牛血清陽(yáng)性檢出率僅為60%（6/10）。因此選用pH7.2 0.1 mol/L PBS作為血清的最佳稀釋液（表3）。

2.1.4最佳血清稀釋倍數(shù)的確定 試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清作1∶1稀釋時(shí)陽(yáng)性檢出率為100%；血清1∶2稀釋的血清的陽(yáng)性檢岀率僅為90%；血清1∶3稀釋的陽(yáng)性檢岀率僅達(dá)80%；健康牛血清用原液檢測(cè)卻岀現(xiàn)10%假陽(yáng)性；健康牛血清進(jìn)行不同比例稀

釋，陰性率均為100%。所以血清進(jìn)行1∶1稀釋（2倍）作為最佳稀釋倍數(shù)（表4）。

表3　血清使用不同pH的PBS稀釋液檢測(cè)結(jié)果Table 3 The test results of PBS with different pH

2.1.5試紙條最佳平衡時(shí)間的確定 試驗(yàn)結(jié)果顯示，試紙條置室溫20、40、60min，檢測(cè)10份血吸蟲陽(yáng)性牛羊血紙及10份健康牛血紙其陽(yáng)性檢岀率分別為80%、100%、100%（表5）。試紙條剛從4℃～8℃冰箱取出因溫度低，抗原與抗體反應(yīng)速度慢，T、C線條帶顏色淺，易造成漏檢。因此，試紙條的最佳平衡時(shí)間為40min～60min。

表4　血清不同稀釋比例的檢測(cè)結(jié)果Table 4 The test results of serum in different dilutions

表5　試紙條不同平衡時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果Table 5 The test results of of strip in different equilibrium time

2.2試紙條檢測(cè)方法的初步評(píng)價(jià)

2.2.1敏感性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，試紙條檢測(cè)10頭牛血紙?jiān)诮臃N前均為陰性；1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)和9號(hào)牛在接種血吸蟲毛蚴的28d時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，檢出率為60%，3號(hào)、5號(hào)、8號(hào)和10號(hào)牛在35d時(shí)也出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，至此所有感染牛的血紙陽(yáng)性檢出率為100%；人工接種42d、49d，所有牛血紙的陽(yáng)性檢出率仍為100%（表6）。

表6　試紙條的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The sensibility test results of the strip

2.2.2特異性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，試紙條檢測(cè)牛、羊血紙陽(yáng)性率100%，檢測(cè)為出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，可見試紙條檢測(cè)血吸蟲不會(huì)與東畢吸蟲和肝片吸蟲出現(xiàn)交叉反應(yīng)（表7）。

2.2.3重復(fù)性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，用5批次試紙條檢測(cè)人工接種血吸蟲尾蚴0、35、42、49d的5頭牛血清及血紙結(jié)果，每批次試紙條均能檢出感染35d～49d的血清和血紙抗體，陽(yáng)性檢岀率為100%，各批次重復(fù)率100%（表8）。

2.2.4符合率試驗(yàn)

2.2.4.1血紙與血清的陰、陽(yáng)性符合率的比較 試驗(yàn)結(jié)果顯示，人工接種牛羊血吸蟲的血紙與血清、自然感染糞孵確診血吸蟲病牛羊血紙與血清的陽(yáng)性符合率均為100%；非血吸蟲病疫區(qū)牛羊血紙與血清的陰性符合率為100%，試紙條檢測(cè)血清和血紙和符合率達(dá)100%（表9）。

表7　試紙條的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 7 The specificity test results of the strip

表8　試紙條的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The repeatability test results of the strip

表9　血紙與血清陰、陽(yáng)性符合率比較試驗(yàn)結(jié)果Table 9 Comparison of coincidence rates of detecting blood papers and sera

2.2.4.2試紙條與Dot-ELISA法的符合率比較試驗(yàn)結(jié)果表明，試紙條與Dot-ELISA法對(duì)人工接種血吸蟲的20份牛血紙檢測(cè)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性符合率達(dá)100%；檢測(cè)健康牛血紙15份均為陰性，陰性符合率達(dá)100%。試紙條與Dot-ELISA法的符合率為100%（表10）。

表10　試紙條與Dot-ELISA的陰、陽(yáng)性符合率比較結(jié)果Table 10 The comparison of coincidence rates between the results determined with strip and Dot-ELISA

2.2.4.3 試紙條與糞孵血吸蟲法的符合率比較

用試紙條測(cè)定糞孵確診為感染血吸蟲病牛血紙15份，所有牛血紙均呈陽(yáng)性反應(yīng)，試紙條與糞孵法的符合率達(dá)100%。

2.2.5試紙條保存期試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果顯示，試紙條在2℃～8℃保存2個(gè)～14個(gè)月，15份陽(yáng)性血吸蟲病牛血紙均檢測(cè)為陽(yáng)性，檢出率均為100%，保存至16和18個(gè)月時(shí)，15份陽(yáng)性樣品分別只能檢測(cè)出14份和11份陽(yáng)性，檢出率分別僅為93.3%和73.3%；試紙條在室溫保存2個(gè)～8個(gè)月時(shí)，15份陽(yáng)性血紙均檢測(cè)呈陽(yáng)性，檢出率均為100%，保存至10、12、14、16和18個(gè)月時(shí)，15份陽(yáng)性血紙分別能檢出14份、10份、9份、5份和4份陽(yáng)性，檢出率依次降為93.3%、66.7%、60%、33.3%和26.7%。試紙條在2℃～8℃和室溫保存2個(gè)～18個(gè)月，15份陰性血紙檢測(cè)均呈陰性，無(wú)假陽(yáng)性出現(xiàn)。結(jié)果表明，試紙條在2℃～8℃保存有效期可長(zhǎng)達(dá)14個(gè)月，在室溫（10℃～34℃）保存的有效期為8個(gè)月。

表11　試紙條在不同溫度的保存期試驗(yàn)結(jié)果Table 11 The detection results of preservation period of the strips under different temperatures

3　討論

3.1試紙條與常用血吸蟲抗體檢測(cè)方法的比較

IHA法是最早用于檢測(cè)血吸蟲抗體的檢測(cè)方法，它特點(diǎn)是以致敏紅血球?yàn)闃?biāo)記物質(zhì)，但致敏紅血球的制備比較繁瑣，制備過程需要二十多步［6］，檢測(cè)時(shí)間比較長(zhǎng)，且需要一定的試驗(yàn)環(huán)境，敏感性不高，不利于基層快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)。ELISA法則是使用酶標(biāo)記的抗抗體進(jìn)行檢測(cè)，該法首先要制備抗抗體，然后再使用辣根過氧化物酶標(biāo)記，其制備過程又長(zhǎng)又繁瑣，在檢測(cè)時(shí)還需要一定的試驗(yàn)環(huán)境和相應(yīng)的試驗(yàn)儀器，需要具有一定專業(yè)技術(shù)的人員操作，不利于快速、廣泛的使用。隨后發(fā)展的金標(biāo)法以及在此基礎(chǔ)上研制的金標(biāo)免疫滲濾法（DIGFA）和二抗金標(biāo)免疫滲濾法（T-DIGFA）均采用膠體金作標(biāo)記物，雖然有易操作、快捷等優(yōu)點(diǎn)，但由該膠體金標(biāo)記的抗原（或抗體）不穩(wěn)定，保存期較短，并且檢測(cè)結(jié)果受NC膜質(zhì)量和批次的影響較大，加上反應(yīng)板體積大，試劑為液體，不能通過航空和鐵路運(yùn)輸，不利于工業(yè)化生產(chǎn)和航空運(yùn)輸。

本試驗(yàn)的抗體檢測(cè)試紙條是依據(jù)乳膠微球免疫層析法（DLIA）進(jìn)行研制，使用紅色乳膠微球作為標(biāo)記物。乳膠是工業(yè)化生產(chǎn)的高分子微球，顆粒大（200nm～300nm）且顆粒大小均一，用它作為顯色示蹤物用更少的抗體或抗原便能清晰顯色；乳膠微球在液體中形成穩(wěn)定的乳液體系，經(jīng)羧基化后與兔抗牛羊IgG以氨基共價(jià)結(jié)合，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，試驗(yàn)結(jié)果顯示試紙條在2℃～8℃保存有效期可長(zhǎng)達(dá)14個(gè)月，在室溫保存的有效期為8個(gè)月，比T-DIGFA法還多保存2個(gè)月［7］。敏感性試驗(yàn)表明試紙條檢測(cè)到血吸蟲抗體的時(shí)間在28d～35d，早于李友等［8］使用間接ELISA診斷方法檢測(cè)試驗(yàn)感染血吸蟲尾蚴抗體陽(yáng)性的時(shí)間35d～56d，具有較好的敏感性。在試驗(yàn)操作上，用試紙條檢測(cè)過程僅需5min～30 min，操作簡(jiǎn)單；目測(cè)判斷結(jié)果，不需特定試驗(yàn)儀器和環(huán)境；為全固態(tài)自顯色測(cè)定裝置，利用運(yùn)輸、郵寄和攜帶。

3.2試紙條符合率、特異性試驗(yàn)及檢測(cè)樣品的選擇

符合率和特異性試驗(yàn)有利于考察試紙條檢測(cè)的準(zhǔn)確性和專一性，避免漏檢或假陽(yáng)性的出現(xiàn)。Dot-ELISA法［9］為血吸蟲抗體檢測(cè)最為普遍使用的方法，而糞孵血吸蟲法又是最為準(zhǔn)確確診法，試紙條與Dot-ELISA法和糞孵血吸蟲法的陰、陽(yáng)符合率均達(dá)到100%，可見試紙條具有很好的普適性和準(zhǔn)確性。特異性試驗(yàn)中選擇東畢吸蟲和肝片吸蟲進(jìn)行交叉反

應(yīng)試驗(yàn)，東畢吸蟲與日本血吸蟲親緣關(guān)系較近且生活史相似，而肝片吸蟲與血吸蟲同為吸蟲綱，以這兩種吸蟲最特異性試驗(yàn)可避免在實(shí)際生產(chǎn)檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性、誤診現(xiàn)象，試驗(yàn)結(jié)果表明該試紙條不與畢吸蟲和肝片吸蟲產(chǎn)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。血紙與血清樣品檢測(cè)的陰陽(yáng)性符合率均為100%，使用血紙為檢測(cè)樣品并不影響檢測(cè)結(jié)果。本方法的檢測(cè)樣品血紙僅采集幾滴血即可制成，樣品采集方便，且比血清樣品更易貯存、運(yùn)輸，又不需要冷藏，有利于基層推廣使用。

3.3結(jié)語(yǔ)

試紙條檢測(cè)操作僅需一步，可大批檢測(cè)又可單份檢測(cè)，短時(shí)間就能目測(cè)判斷結(jié)果，不需任何儀器設(shè)備，攜帶方便，便于運(yùn)輸，適用于基層血吸蟲病的監(jiān)測(cè)、普查及檢疫。該試紙條穩(wěn)定性好，保存期長(zhǎng)，反應(yīng)結(jié)果也可長(zhǎng)期保存，以利于回顧性分析和研究。該技術(shù)在血吸蟲病流行區(qū)推廣應(yīng)用，可節(jié)省大量的人力、物力和財(cái)力，其推廣使用對(duì)鞏固血防成果，促進(jìn)畜牧業(yè)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重要意義，具有良好的推廣使用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。

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Development of Diagnostic Strip for Detecting Cattle and Sheep Antibodies Against Schistosoma japomicum

YANG Ai-guo1，ZHOU Yu2，GUO Li1，DONG Guo-dong3，DENG Yong-qiang1，HOU Wei1，WU Yun-fei4，TIAN Hui-yun2，MA Kun3，CHEN Dong1，WEN Hao1，ZHU Yin-bao5
（1.Sichuan Animal Disease Prevention and Control Center，Chengdu，Sichuan，610041，China；2.Hubei Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan，Hubei，430000，China；3.Yunnan Animal Disease Prevention and Control Center，Kunming，Yunnan，650051，China；4.Guanghan City Animal Disease Prevention and Control Center，Deyang，Sichuan，618000，China；5.Nanjing Lubao Biological Technology Co.，LTD，Nanjing，Jiangsu，210000，China）

Abstract：In order to establish a rapid method to detect the antibodies of Schistosoma japomicumin cattle and sheep，a diagnostic strip was produced based on using rabbit anti-Cattle IgG labeled with red latex as an immunoprobe，the soluble egg antigen of Schistosoma japomicumand goat anti-rabbit IgG as a test line and control line，respectively.It could detect the circulating anti-schistosome antibodies in blood paper from cattle which had been infected with schistosome cercariae after 28days（including 28days）.There was no cross reaction with the antibodies of Orientobilharziaand Faciola hepatica.In this study，20positive samples from cattle with schistosomiasis and 30negative samples from cattle without schistosomiasis were detected with the diagnostic strip，Dot-ELISA and feces hatching miracidium method.The positive and negative coincidence rates were 100%compared with Dot-ELISA and feces hatching miracidium method.The antibody detection strips still kept valid after storage in 2℃-8℃for 14months or kept in room temperature for 8months.The results showed that the strips have high sensitivity，specificity，repeatability and stability.It is suitable for fast diagnosis and general survey of animal schistosomiasis.

Key words：antibody detection strip；schistosomiasis；livestock；rapid diagnosis

作者簡(jiǎn)介：陽(yáng)愛國(guó)（1967-），男，博士，研究員，主要從事動(dòng)物寄生蟲病及獸醫(yī)公共衛(wèi)生防控工作。

收稿日期：2014-09-18

中圖分類號(hào)：S852.735

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0073-08