任　方，易　忠，米曉云，魏　婕，馬文戈，郭會玲，苗書魁，汪立群，王　延，薛　英，黃　炯，魏玉榮＊（.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊830063；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊83005）

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環(huán)形泰勒蟲表面抗原Tasp-Spag1基因串聯(lián)表達及其蛋白生物信息學分析

任方1，3，易忠1，米曉云1，魏婕1，馬文戈1，郭會玲1，苗書魁1，汪立群2，王延1，薛英1，黃炯1，魏玉榮1＊
（1.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊830063；3.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊830052）

摘 要：研究環(huán)形泰勒蟲表面抗原特性，以原核表達系統(tǒng)串聯(lián)表達其表面抗原Tasp-Spag1，并對其蛋白進行生物信息學分析。通過PCR技術擴增Tasp-Spag1基因片段后構建重組質粒pET-28a-Tasp-Spag1，IPTG誘導重組蛋白表達，SDS-PAGE、Western blot檢測；運用生物信息學軟件對Tasp-Spag1基因片段進行分析，并預測其編碼蛋白的主要特性與抗原表位。結果顯示，擴增得到Tasp-Spag1基因長度為729bp，原核表達后通過SDS-PAGE與Western blot檢測顯示，得到大小與預期分子質量相當?shù)哪康牡鞍?；生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，此串聯(lián)重組蛋白Tasp-Spag1具有236個氨基酸，屬于不穩(wěn)定的非分泌型、非跨膜親水蛋白，分別具有33個與21個可能的糖基化與磷酸化位點，有三段低復雜性的結構域，并且含有Sorb、NL的同源區(qū)域，可能有10個B細胞表位優(yōu)勢區(qū)段與7個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)段，具有兩段交叉反應性表位肽。

關鍵詞：環(huán)形泰勒蟲；串聯(lián)重組蛋白；原核表達；生物信息學

環(huán)形泰勒蟲病是由寄生于動物紅細胞、淋巴細胞及巨噬細胞內的環(huán)形泰勒蟲（Theileria annula-

櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙

ta）引發(fā)的一種蜱傳急性、熱性血液原蟲病。此病呈地方流行性，不僅發(fā)病率與死亡率較高，當病畜耐過此病或治愈后，體內仍存在低水平的蟲體，導致抵抗力下降，或其他疾病暴發(fā)時再次誘發(fā)此?。?-2］。

裂殖體表面抗原（Theileria annulata surface protein，Tasp）與子孢子表面抗原（sporozoite antigen，Spag1）已被確認具有較好的免疫原性，可作為診斷與預防環(huán)形泰勒蟲病的理想候選抗原［3-4］。環(huán)形泰勒蟲存在表面抗原的多態(tài)性，串聯(lián)表面優(yōu)勢抗原可為篩選理想的候選抗原提供一條新的思路。

本研究應用PCR方法擴增環(huán)形泰勒蟲Tasp-Spag1基因片段，并對Tasp-Spag1基因進行原核表達，通過Western blot檢測原核表達產(chǎn)物的反應性，通過生物信息學方法分析此串聯(lián)表面蛋白的主要特性，推測其蛋白可能存在的抗原表位優(yōu)勢區(qū)段，為深入研究串聯(lián)重組蛋白的免疫原性提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質粒及細胞 質粒pMD-TaSPSPAG1、pET-28a、BL21（DE3）表達宿主菌由由新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所傳染病研究室保存；pEASY-T1載體、Trans1-T1感受態(tài)細胞為北京全式金公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑 DNA聚合酶、2.5mmol/L的dNTP mixture、10×buffer（Mg2+plus）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、小量質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為Bio-Labs公司產(chǎn)品；4×SDS雙色加樣緩沖液為武漢博士德生物公司產(chǎn)品；牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清為新疆畜牧科學院獸醫(yī)所提供；HRP標記的兔抗牛IgG為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物的設計與合成 根據(jù)質粒pMD-TaSPSPAG1序列，應用Oligo 6軟件設計擴增Tasp-Spag1基因片段的引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列如下：TS F：5′-AATGGATCC（BamHⅠ）ATGGAAGATCAACAGCCTTTG-3′；TS R：5′-AACCTCGAG（XhoⅠ）TTAGAGTTTGTTTTTGATCTTTTG-3′。

1.2.2基因片段PCR擴增 以質粒pMD-TaSPSPAG1為模板，擴增Tasp-Spag1基因片段，PCR反應體系25μL：2.5μL 10×buffer（Mg2+plus），4μL 2.5mmol/L dNTPs，20μmol/L上下游引物各1μL，0.3μL模板DNA，0.25μL 5 U/μL TaqHS，15.95μL ddH2O。擴增反應程序分別為：94℃5min；94℃45s，53.4℃30s，72℃42s，30個循環(huán)；72℃10min；4℃終止反應。經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收純化。

1.2.3pEASY-T1-Tasp-Spag1載體的構建 回收純化的PCR產(chǎn)物與pEASY-T1載體連接，按試劑盒說明操作后轉化至Trans1-T1感受態(tài)細胞中。培養(yǎng)后挑取單菌落搖菌提取質粒并鑒定，鑒定正確的質粒命名為pEASY-T1-Tasp-Spag1。

1.2.4重組表達載體的構建與鑒定 pEASY-T1-Tasp-Spag1重組質粒與原核表達載體pET-28a同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切并回收目的片段后，在T4DNA Ligase的作用下連接，按T4Ligase說明操作，將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)細胞中培養(yǎng)并提取重組質粒。重組質粒pET-28a-Tasp-Spag1雙酶切鑒定后測序，測序正確后，將重組質粒轉化至菌株BL21（DE3）中。

1.2.5重組質粒的誘導表達 挑取陽性轉化菌落接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基（Kan+）中，37℃220r/min震蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100的體積將菌液接種于LB液體培養(yǎng)基（Kan+）中繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD600nm=0.4～0.8時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，誘導表達4h。同時以誘導前的菌液與誘導的轉化pET-28a空載體的菌液作為對照。將培養(yǎng)好的菌液5 000r/min離心5min，收集菌體，洗滌后加入滅菌的PBS緩沖液（pH7.4），懸浮菌體后充分超聲破碎菌體，待菌體澄清透明后加入上樣緩沖液煮沸10min后，取10μL進行120g/L SDS-PAGE電泳檢測分析。

1.2.6重組表達蛋白的Western blot檢測 表達的蛋白轉至NC膜后，用含50g/L脫脂牛奶的PBST封閉4℃過夜，以牛環(huán)形泰勒蟲陽性血清（1∶100）為一抗，孵育2h，PBST緩沖液洗膜后，以HPR標記的兔抗牛IgG為二抗，孵育1h，用PBST緩沖液洗滌后進行DAB顯色后拍照保存。

1.2.7重組蛋白Tasp-Spag的生物信息學分析運用Expasy、TMPRED、SignalIP、SOPMA、CBS、SMART、COMPLUTENSE、ABCpred、SYFPEITHI、NetMHC等在線生物軟件，結合DNA Star、DNA Man等生物軟件，分析和預測Tasp-Spag1重組蛋白的主要特性、糖基化與磷酸化位點、抗原表位等。

2　結果

2.1Tasp-Spag1基因的PCR擴增

以質粒pMD-TaSP-SPAG1為模板進行PCR擴增，獲得與預期相符的長約729bp的目的條帶（圖1）。

圖1　Tasp-Spag1基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplilation of Tasp-Spag1gene

2.2Tasp-Spag1基因原核表達載體構建結果

重組質粒pET-28a-Tasp-Spag1經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定得到長約729bp的基因片段與5 369bp的pET-28a載體片段（圖2），大小與理論值相符。

圖2重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3重組質粒的誘導表達結果

用1mmol/L IPTG誘導重組菌，誘導時間為4h后，應用SDS-PAGE電泳檢測分析，與對照組相比，得到大小與預期分子質量相當?shù)哪康牡鞍祝▓D3）。

2.4重組表達蛋白的Western blot檢測

用牛環(huán)形泰勒蟲病陽性血清抗體進行免疫印跡試驗，與SDS-PAGE電泳膠相對應的位置出現(xiàn)特異性雜交條帶，而對照的表達產(chǎn)物則無此條帶（圖4），可以確定重組蛋白表達且具有反應原性。

2.5重組蛋白Tasp-Spag1的生物信息學分析

2.5.1Tasp-Spag1重組蛋白的基本性質 重組蛋白TaSP-SPAG1編碼236個氨基酸，分子質量為24.97ku。等電點理論值為4.21，半衰期為30h，平均親水系數(shù)為-1.172，不穩(wěn)定系數(shù)為62.62，歸類為親水性不穩(wěn)定蛋白。

重組蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域且分布均勻，可以形成豐富的二級結構（圖5）；重組蛋白主要區(qū)域均位于蛋白親水區(qū)域，表明此區(qū)域可能是B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域（圖6）。

圖3　重組蛋白的誘導表達Fig.3 Induced expression of the recombinant protein

圖4　重組蛋白Western blot的檢測Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

圖5　重組蛋白Tasp-Spag1柔韌性分析Fig.5 Analysis of the flexibility of the recombinant protein Tasp-Spag1

圖6　重組蛋白Tasp-Spag1表面可能性、親水性分析Fig.6 Analysis of the surface probability and hydrophobicity of the recombinant protein Tasp-Spag1

重組蛋白質存在兩個疏水區(qū)域（圖7），具體位置為129-138、167-174。結果顯示，親水性的最高分為-2.989，疏水性的最高分為1.456，整個多肽鏈分值大部分都大于0，說明這些蛋白屬親水性蛋白。TMPRED分析發(fā)現(xiàn)，此蛋白不存在可能的跨膜區(qū)域及信號肽。因此，預測重組蛋白Tasp-Spag1屬于非分泌型非跨膜蛋白。

2.5.2Tasp-Spag1重組蛋白的翻譯后修飾位點 預測可知，Tasp-Spag1重組蛋白氨基酸序列存在1個潛在的N-糖基化位點（Asn 200）；31個潛在的O-糖基化位點（Thr26、Thr38、Ser41、Thr48、Thr50、Thr58、Ser59、Ser62、Ser65、Thr66、Thr68、Ser78、Thr92、Ser94、Thr95、Thr97、Ser100、Ser101、Ser102、Thr158、Ser169、Ser180、Thr183、Thr185、Ser188、Thr195、Thr196、Thr202、Thr205、Thr206 和Thr207）。對Tyr、Ser和Thr磷酸化位點進行預測，發(fā)現(xiàn)Tasp-Spag1重組蛋白含21個潛在的磷酸化位點（Ser19、Ser29、Ser41、Ser59、Ser62、Ser78、Ser100、Ser101、Ser102、Ser118、Ser123、Ser125、Ser142、Ser152、Ser155、Ser156、Thr58、Thr66、Thr68、Thr95和Thr207）。

2.5.3Tasp-Spag1重組蛋白二級結構的預測 預測Tasp-Spag1重組蛋白二級結構中可能存在40個α螺旋（總長的16.95%），184個無規(guī)則卷曲（占77.97%），12個延伸鏈（占5.08%）（圖8）。

2.5.4Tasp-Spag1重組蛋白結構功能域分析Tasp-Spag1氨基酸序列28-83位、110-142位及195-228位間為低復雜性的結構域，且81-120位之間含有Sorb的同源區(qū)域，96-121位之間含有NL的同源區(qū)域。

2.5.5Tasp-Spag1重組蛋白抗原表位的預測 預測Tasp-Spag1重組蛋白具有6個B細胞抗原表位優(yōu)勢區(qū)域（圖9和表1）和7個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)域（表2），綜合重組蛋白Tams1-Spag的B細胞及T細胞表位優(yōu)勢區(qū)域，重組蛋白Tams1-Spag的T、B細胞聯(lián)合表位可能的區(qū)域為162-171aa（KPAELGPSLV）、87～94（VVDKFSPL）。

圖7　重組蛋白Tasp-Spag1疏水性分析Fig.7 Analysis of the hydrophobicity of the recombinant protein Tasp-Spag1

圖8　重組蛋白Tasp-Spag1二級結構分析Fig.8 Secondary structure prediction of the recombinant protein Tasp-Spag1

圖9　重組蛋白Tasp-Spag1抗原表位分析Fig.9 Analysis of the antigenic epitopes of the recombinant protein Tasp-Spag1

表1　重組蛋白Tasp-Spag1的B細胞抗原表位Table 1 The B cell antigenic epitopes of the recombinant protein Tasp-Spag1

表2　重組蛋白Tasp-Spag1的T細胞抗原表位Table 2 The T cell antigenic epitopes of the recombinant protein Tasp-Spag1

3　討論

Tasp是環(huán)形泰勒蟲感染紅細胞時表面分泌的一種膜內蛋白，其免疫原性很好。Tasp已被成功運用于環(huán)形泰勒蟲病的診斷中［5-6］，Mohamed A M等［7］對Tasp作為ELISA抗原檢測環(huán)形泰勒蟲病進行了評估，證實了此方法的可靠性。當蟲體感染宿主時，產(chǎn)生的抗TasP的抗體同樣具有良好的免疫原性，可以作為診斷環(huán)形泰勒蟲病的理想抗原［8-10］。Spag1是蟲體發(fā)育至子孢子階段時分泌的一種膜內蛋白，具有較好的反應原性。雖然此兩種表面抗原的免疫原性均已被驗證并在實際診斷中應用，但以單一抗原為基礎的診斷方法還存在著一些問題［11］。而對環(huán)形泰勒蟲不同發(fā)育階段的串聯(lián)表面優(yōu)勢抗原蛋白的研究則為篩選理想的候選抗原提供了一條新的思路。環(huán)形泰勒蟲的高免疫原性區(qū)片段串聯(lián)表達，并以此為基礎，建立以重組蛋白Tasp-Spag為包被抗原的間接ELISA檢測方法［12-13］，證實了串聯(lián)抗原重組蛋白的可行性。而運用生物信息學方法預測存在的抗原表位，并對抗原表位進行分析及預測其免疫原性，是研究診斷試劑與表位疫苗的有效方法［14］。

本研究對Tasp-Spag1串聯(lián)重組蛋白的基本特性、二級結構、親水性、表面可能性、柔韌性等參數(shù)進行預測，并綜合推測其可能存在的B細胞表位，同時預測了該蛋白可能的磷酸化與糖基化位點［15-18］。串聯(lián)重組蛋白Tasp-Spag1含有236個氨基酸屬于不穩(wěn)定的非分泌型、非跨膜親水性蛋白。分別含有33個與21個可能的糖基化與磷酸化位點，蛋白的磷酸化是病原生物感染、復制、轉錄等相關的信號傳遞中最基本的反應，即細胞外膜感應的信號通過相應分子的先后磷酸化從膜傳遞到細胞核，進而開啟相關基因的轉錄并且以此指導翻譯蛋白質執(zhí)行細胞的功能［19］。而糖基化現(xiàn)象存在于超過50%的蛋白質中，與蛋白質降解，蛋白質翻譯調控與細胞免疫等有著密切的關系，并且對蛋白質的生物學性質起著非常重要的作用。在28-83位、110-142位及195-228位氨基酸之間存在低復雜性的結構域，在81-120位之間存在Sorb的同源區(qū)域，96-121位之間含有NL的同源區(qū)域。此串聯(lián)重組蛋白可能含有10個B細胞表位優(yōu)勢區(qū)段與7個T細胞表位優(yōu)勢區(qū)段，含有兩段交叉反應性表位肽，分別可能存在的區(qū)域為162-171aa（KPAELGPSLV）、87-94aa（VVDKFSPL），此區(qū)域同時參與體液免疫與細胞免疫，所以在抗原表位的篩選中具有重要意義。本研究在BL21（DE3）中成功表達了重組蛋白，經(jīng)Western blot檢測表明其可被環(huán)形泰勒蟲病陽性血清識別，為進一步進行環(huán)形泰勒蟲亞單位疫苗的研究提供理論基礎。

參考文獻：

［1］ 蔣金書.動物原蟲?。跰］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2000：120-125.

［2］ 汪 明.獸醫(yī)寄生蟲學［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2008：332.

［3］ 農(nóng)業(yè)部畜牧獸醫(yī)局.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類動物疫病釋義［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004：97-101.

［4］ 藺紅玲，張繼瑜，魏小娟，等.環(huán)形泰勒蟲主要膜蛋白的研究進展［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（5）：22-24.

［5］ 黃家雨.新疆牛環(huán)形泰勒蟲Tams1基因的克隆、表達與巢式PCR診斷方法的建立［D］.新疆烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2008.

［6］ Ghoneim A M，EI-Fayomy A O.Targeting tams-1gene results in underestimation of Theileria annulata infection in diseased cattle in Egypt［J］.Acta Parasitol，2014，59（1）：85-90.

［7］ Mohamed A M，Abdel-Rady A，Ahmed L S，et al.Evaluation of indirect TaSP enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of tropical theileriosis in cattle（Bos indicus）and water buffaloes（Bubalus bubalis）in Egypt［J］.Vet Parasitol，2012，186（3-4）：486-489.

［8］ Darghouth M A，Boulter N R，Gharbi M，et al.Vaccination of calves with an attenuated cell line of Theileria annulataand the sporozoite antigen SPAG-1produces a synergistic effect［J］.Vet Parasitol，2006，142（1-2）：54-62.

［9］ Salih D E，Ahmed J S，Bakheit M A，et al.Validation of the indirect TaSP enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of Theileria annulatainfection in cattle［J］.Parasitol Res，2005，97（4）：302-308.

［10］ Bakheit M A，Schnittger L，Salih D A，et al.Application of the recombinant Theileria annulata surface protein in an indirect ELISA for the diagnosis of tropical theileriosis［J］.Parasitol Res，2004，92（4）：299-302.

［11］ 曹雯麗，陳 亮，劉啟生，等.新疆牛環(huán)形泰勒蟲病的流行現(xiàn)狀和防治［J］.草食家畜，2011（3）：76-78.

［12］ 魏玉榮，易 忠，馬文戈，等.泰勒焦蟲表面抗原Tams1、Spag1 和Tasp基因的克隆與表達［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學，2013，50（11）：2136-2142.

［13］ 魏玉榮，易 忠，馬文戈，等.泰勒焦蟲重組蛋白Tasp-Tams1-Spag1間接ELISA檢測方法的建立［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2013，36（5）：360-365.

［14］ 孫清鵬.生物信息學應用教程［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2012：6-148.

［15］ Hopp T P.Protein surface analysis：Methods for identifying antigenic determinants and other interaction sites［J］.J Immunol Meth，1986，88（1）：1-18.

［16］ 薛慶中，陳 辰，陳曉龍.DNA和蛋白質序列數(shù)據(jù)分析工具［M］.3版.北京：科學出版社，2012：71-104.

［17］ Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al.SignalP4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions［J］. Nat Meth，2011，8（10）：785-786.

［18］ 吳祖建，高芳鑾，沈建國.生物信息學分析實踐［M］.北京：科學出版社，2010：126-129.

［19］ 王立榮.信號通路相關文獻挖掘與分析方法研究［D］.安徽合肥：中國科學技術大學，2007.

Expression and Bioinformatics Analysis of Tasp-Spag1 Genes of Theileria annulata

REN Fang1，3，YI Zhong1，MI Xiao-yun1，WEI Jie1，MA Wen-ge1，GUO Hui-ling1，MIAO Shu-kui1，WANG Li-qun2，WANG Yan1，XUE Ying1，HUANG Jiong1，WEI Yu-rong1
（1.Institute of Veterinary Medicine，Xinjiang of Animal Science Academy，Urumqi，Xinjiang，830000，China；2.Institute of Animal Health Supervision Station Inspection，Urumqi，Xinjiang，830063，China；3.College of Veterinary Medicine，Xinjiang
Agricultural University，Urumqi，Xinjiang，830052，China）

Abstract：To explore the characteristics of the Theileriaannulatasurface antigens，the surface antigen Tasp-Spag1genes were co-expressed in prokaryotic expression system.To bioinformatically analyze the surface antigen Tasp-Spag1genes.Tasp-Spag1genes were amplified by PCR method to construct recombinant plasmid of pET-28a-Tasp-Spag1.After the inducible expression by IPTG，SDS-PAGE，Western blot analyses were used.Bioinformatics software was used to analyze the Tasp-Spag1genes，the main characters and antigenic epitopes were predicted.Tasp-Spag1genes were about 729bp amplified by PCR，then，the result of SDS-PAGE，Western blot showed that the target protein was obtained with a molecular weight same as the expected size；Based on the bioinformatics analysis，the recombinant Tasp-spag1contains 236amino acids and belongs to unstable hydrophilic nonsecreted non-transmembrane protein.It contains 33glycosylation sites and 21phosphoric sites，3low complexity domain and Sorb，NL homologous regions.There may be 10 B-cell major epitope domains and 7 T-cell major epitope domains and two cross-reactive epitopes.The predicted results indicated that two different recombinant proteins have good immunogenicity in theory.

Key words：Theileria annulata；recombinant protein；prokaryotic expression；bioinformatics

通訊作者

作者簡介：任 方（1989-），女，新疆人，碩士研究生，主要從事動物病毒病研究。＊

基金項目：國家自然科學 （31160505）

收稿日期：2014-09-13

中圖分類號：S852.723

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0063-06