郝桂英（西昌學院，四川西昌615013）

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豬囊尾蚴西昌分離株線粒體Cytb和nad4基因的序列測定與種系發(fā)育分析

郝桂英
（西昌學院，四川西昌615013）

摘 要：利用PCR技術(shù)對2個豬囊尾蚴西昌分離株的線粒體細胞色素b（Cytb）基因全序列和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位4（nad4）基因部分序列（pnad4）進行擴增，分析其遺傳變異，并用MEGA 5.0程序NJ法繪制種系發(fā)育樹，探討不同地區(qū)來源的豬囊尾蚴種系發(fā)育關(guān)系。測序結(jié)果顯示，2個豬囊尾蚴分離株的Cytb基因全序列長度均為1 068bp，nad4基因部分序列長度均為815bp，核苷酸序列同源性均為99.8%。種系發(fā)育分析結(jié)果顯示，所有豬囊尾蚴分離株形成一個分支，2個西昌分離株均屬于豬帶絳蟲亞洲基因型。結(jié)果表明，Cytb和nad4基因均可用于豬帶絳蟲的分子分類，為豬帶絳蟲病/豬囊尾蚴病的分子診斷奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬囊尾蚴；Cytb基因；nad4基因；種系發(fā)育

豬囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）是豬帶絳蟲（Taenia solium）的中絳期，寄生于豬、人等的肌肉、腦、眼等處，引起囊尾蚴?。?］。該病呈世界性分布，是一種危害嚴重的人獸共患寄生蟲病，在中國、印度、印尼、泰國、老撾、柬埔寨、尼泊爾、菲律賓、緬甸、越南、韓國、肯尼亞、坦桑尼亞、墨西哥等國家廣泛流行［2-3］。我國東北、西北、東部和南部等地感染率均較高［4］。豬帶絳蟲病/豬囊尾蚴病仍然是全世界不可忽視的公共衛(wèi)生問題［5］。

豬帶絳蟲及其中絳期在形態(tài)上與其他2種帶絳蟲（牛帶絳蟲、亞洲帶絳蟲）很難區(qū)分，同時由于受自然、地理等生態(tài)環(huán)境因素的長期影響，寄生蟲種、株間發(fā)生不同程度的遺傳分化，這些變化很難用形態(tài)學方法所區(qū)分。DNA序列分析比形態(tài)學方法具有更強的鑒別力，可精確測量生物自然種群的遺傳變異程度，是目前進行物種遺傳變異、分子分類和分子種系發(fā)生等研究的主要手段之一，為寄生蟲的準確鑒定和系統(tǒng)學研究提供了有力的工具，彌補了傳統(tǒng)分類方法的不足。國內(nèi)外已有不少學者應用DNA序列分析對世界不同地區(qū)豬帶絳蟲分離株進行分子鑒別和基因分型［6-9］。

細胞色素b（Cytb）基因是物種間高度保守的一個線粒體基因［10］，近年被用于帶科絳蟲的系統(tǒng)進化分析，也是最早用于豬帶絳蟲病分子診斷［11］和基因型分析的基因之一［6］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位4（nad4）基因是線粒體上進化速率較快的基因，但目前還沒有用于豬帶絳蟲分子鑒別和基因分型的報道。

本研究對四川省西昌市2個豬囊尾蚴分離株的線粒體Cytb基因全序列和nad4基因部分序列（pnad4）進行PCR擴增和序列分析，并應用兩者重構(gòu)豬帶絳蟲的種系發(fā)育關(guān)系，為豬帶絳蟲病/豬囊尾蚴病的分子診斷奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1豬囊尾蚴的采集 從四川省西昌市某肉聯(lián)廠屠宰的2只感染有豬囊尾蚴的豬只的肌肉，剝離出囊尾蚴，用無菌生理鹽水清洗3次，分別標記為XC1和XC2，并放于-20℃保存?zhèn)溆?。分離自同一只豬的囊尾蚴為1個分離株。

1.1.2主要試劑 2×Taq PCR MasterMix、柱式DNA膠回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3引物設(shè)計 以GenBank上已發(fā)表的豬帶絳蟲（T.solium）線粒體全基因組（GenBank登錄號：AB086256）為模板分別設(shè)計2對引物。引物序列分

別為CytbP1：5′-AAACTGATAGATTGTGGTTC-3′，CytbP2：5′-ATATGACTRTCWTTAGAAGA-3′；pnad4P1：5′-TTAGTGAGTCTCCTTATTCTGA-3′，pnad4P2：5′-ACACACTCATAACACTCCC-3′。引物序列由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2方法

1.2.1豬囊尾蚴基因組DNA的提取 用蛋白酶K消化和酚/氯仿法［12］提取豬囊尾蚴基因組DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2線粒體Cytb和nad4基因的擴增、純化與序列測定 以提取的豬囊尾蚴基因組DNA為模板進PCR擴增。PCR擴增體系為50μL：2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物P1、P2（10pmol/L）各2μL，模板DNA 2μL，ddH2O 19μL，混勻后瞬時離心15s。同時，以ddH2O代替模板DNA作空白對照。Cytb擴增條件：95℃5min；95℃30s，48℃45s，72℃1min，共30個循環(huán)；最后72℃5min。pnad4擴增條件：95℃5min；95℃30s，48℃30s，72℃ 45s，共30個循環(huán)；最后72℃5min。反應結(jié)束后分別取5μL PCR擴增產(chǎn)物進行10g/L瓊脂糖凝膠電泳。各PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)柱式DNA膠回收試劑盒進行回收純化，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 檢索GenBank收錄的所有不同國家/地區(qū)的豬帶絳蟲的Cytb基因全序列和nad4基因序列并下載（表1）。用Clustal X 1.81軟件對目標序列進行排序比對，生成供系統(tǒng)發(fā)育分析的矩陣。用MEGA 5.0軟件檢查序列是否出現(xiàn)終止子、堿基插入/缺失，計算序列堿基含量和差異、轉(zhuǎn)換/顛換比率，并基于K2P模型計算遺傳距離；用DNA Star軟件中的MegAlign程序進行序列同源性分析。

以帶科棘球?qū)俚募毩＜蚪{蟲（Echinococcus granulosus）（GenBank登錄號：NC＿008075）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ樹，并進行重復1 000次的自舉檢驗（bootstrap test）。

表1　不同來源的豬帶絳蟲的線粒體Cytb和nad4基因序列信息Table 1 Information of mitochondrial Cytb and nad4genes of T.soliumfrom different countries

2　結(jié)果

2.1Cytb基因全序列和pnad4序列的特征及同源性

經(jīng)比對校正后，2個豬囊尾蚴西昌分離株的Cytb基因全長1 068bp，不存在堿基插入/缺失。保守位點1 066個，變異位點2個，發(fā)生在密碼子的第2位和第3位。R（si/sv）平均值為348.967，僅有轉(zhuǎn)換位點（1個T-C和1個A-G），無顛換位點。A、T、C、G堿基的平均含量分別為23.7%、46.3%、9.2%、20.8%。2個測序序列核苷酸同源性為99.8%，遺傳距離0.002；與已知豬帶絳蟲同源基因的核苷酸序列同源性為97.8%～99.8%，與帶屬其他絳蟲同源基因的同源性低于86.0%。

2株豬囊尾蚴的pnad4序列長度均為815bp（占全長的67%），無堿基插入/缺失。保守位點813個，僅2個變異位點，發(fā)生在密碼子的第2位和第3位，均為T-C的轉(zhuǎn)換，R（si/sv）平均值為111.58。A、T、C、G堿基的平均含量分別為22.3%、48.5%、8.2%、21.0%。2個測序序列核苷酸同源性為99.8%，遺傳距離0.002；與已知豬帶絳蟲（AB086256）同源基因的核苷酸序列同源性分別為99.5%和99.8%，與帶屬其他絳蟲同源基因的同源性低于85.0%。

2.2種系發(fā)育分析

基于Cytb基因全序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹顯示不同地域的豬帶絳蟲分離株位于同一支，能與豆狀帶絳蟲（T.pisiformis）、泡狀帶絳蟲（T.hydatige-

na）、多頭帶絳蟲（T.multiceps）、牛帶絳蟲（T.saginata）、亞洲帶絳蟲（T.asiatica）、肥頭帶絳蟲（T. crassiceps）、帶狀帶絳蟲（T.taeniaeformis）很好地鑒別，且有效地區(qū)別出亞洲和非洲/拉丁美洲2種基因型豬帶絳蟲（圖1）。XC1和XC2位于亞洲基因型分支上，說明2個西昌分離株屬于亞洲基因型。但馬達加斯加分離株在亞洲基因型分支和非洲/拉丁美洲基因型分支上均有分布?；趎ad4基因部分序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹顯示豬帶絳蟲分離株單獨形成1個分支，能與帶屬其他絳蟲鑒別開（圖2）。

圖1　基于Cytb基因全序列NJ法構(gòu)建的不同地域豬帶絳蟲的種系發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of T.soliumfrom different regions based by Cytb gene complete sequence on neighbor-joining analyses

3　討論

豬囊尾蚴病被列為市場肉品檢疫的必檢項目，也是公認的社會經(jīng)濟病之一［13］。四川省涼山州17個縣（市）均有不同程度的豬囊尾蚴病發(fā)生，尤以彝族聚居的昭覺、美姑、普格等縣的邊遠高寒山區(qū)感染率高，感染強度大［14］。目前還缺少關(guān)于該地區(qū)豬帶絳蟲分子鑒定和基因分型的報道。

圖2　基于nad4基因部分序列NJ法構(gòu)建的不同地域豬帶絳蟲的種系發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of T.soliumfrom different regions based on nad4gene partial sequence by neighbor-joining analyses

本研究擴增了四川省西昌市2個豬囊尾蚴分離株的Cytb基因全序列和nad4基因部分序列，序列分析表明，2個分離株的堿基序列存在較小差異，Cytb基因全序列和nad4基因部分序列堿基差異均為0.02%。這與Gasser R B等［15］研究結(jié)果一致，他們認為不同豬帶絳蟲分離株間的線粒體DNA（mtDNA）分子標記具有很小甚至沒有遺傳變異。Nakao M等［7］報道13株分離自亞洲（中國、泰國、印尼和印度）、拉丁美洲（墨西哥、秘魯、厄瓜多爾、玻利維亞和巴西）和非洲（坦桑尼亞、莫桑比克和喀麥?。┑呢i囊尾蚴Cytb基因全序列中有31個堿基變異（占全長的2.9%），構(gòu)建的進化樹將其分為亞洲基因型和拉丁美洲/非洲基因型。且2個基因型的Cytb差異為1.6%～2.1%。他們認為Cytb基因不僅能區(qū)分豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲，還能區(qū)分豬帶絳蟲的2個基因型，是比cox1基因更適用于近緣種系統(tǒng)進化關(guān)系分析和種內(nèi)變異分析的分子標記。Martinez-Hernandez F等［16］研究結(jié)果證實線粒體基因是比核基因更適于作為研究豬帶絳蟲變異的分子標記，他們發(fā)現(xiàn)cox1、Cytb和nad比5.8S+ITS1+ 18S、LMWA1和LMWA2具有更高的多態(tài)位點和信息位點比例。Palafox-Fonseca H等［17］對分離自墨西哥的12位腦囊蟲患者的28個分離株的Cytb基因進行分析，發(fā)現(xiàn)均屬于非洲/拉丁美洲基因型。

通過對2個豬囊尾蚴西昌分離株的Cytb基因全序列和nad4基因部分序列的分析和同源性研究，揭示豬帶絳蟲的Cytb基因和pnad4基因種內(nèi)保守，差異較小，但種間差異較大，均可作為鑒別豬帶絳蟲的種間遺傳標記?；贑ytb基因全序列構(gòu)建的種系發(fā)育樹顯示2個西昌豬囊尾蚴分離株均屬于亞洲基因型豬帶絳蟲。

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Sequencing and Phylogenetic Analysis of Mitochondrial Cytb Gene and nad4 Gene of Cysticercus cellulosae Xichang Isolates

HAO Gui-ying
（Xichang College，Xichang，Sichuan，615013，China）

Abstract：The complete sequences of mitochondrial cytochorome b（Cytb）gene and the partial sequences of NADH dehydrogenase subunit 4gene（pnad4）of 2 C.cellulosae samples isolated from Xichang were amplified by PCR，and sequenced to analyse their genetic variations，NJ phylogenetic trees were reconstructed using the MEGA version 5.0software.The results showed that the complete sequence of Cytb gene and partial sequence of nad4gene of C.cellulosae were 1 068bp and 815bp，respectively.The nucleotide sequence homology was 99.8%in two isolates based on Cytb gene and nad4gene.The phylogenetic trees showed that all the C.cellulosaeisolates were formed a single cluster，and the two Xichang isolates belong to Asian genotype.The results indicated that Cytb gene and nad4gene can be used to molecular classification of Taenia solium，and established the foundation for molecular diagnosis of taeniasis/cysticercosis. Key words：Cysticercus cellulosae；Cytb gene；nad4gene；phylogenetic relationship

作者簡介：郝桂英（1980-），女，四川自貢人，副教授，博士，主要從事動物寄生蟲病學研究。

基金項目：四川省高校重點實驗室基本科研業(yè)務費項目（縱341B）

收稿日期：2014-08-16

中圖分類號：S852.734；S858.28

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0059-05