辛任升，劉　宇，梁劍平（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

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苦豆子灌注劑質(zhì)量的檢測(cè)

辛任升，劉宇，梁劍平＊
（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730050）

摘 要：為建立苦豆子灌注劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法（TLC）法對(duì)苦豆子灌注劑進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測(cè)定槐定堿含量。TLC中，苦豆子灌注劑與槐定堿對(duì)照品在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，且專屬性強(qiáng)、分離效果好；槐定堿進(jìn)樣量在0.2mg/mL～1mg/mL（r=0.999 6）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為98.84%（RSD=0.338%，n=6）。因此，所建標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：苦豆子灌注劑；槐定堿；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；高效液相；薄層色譜

苦豆子（Sophora alopecuroides）是豆科（Leguminosae）槐屬（Sophora）多年生草本植物［1］，主要分布于我國(guó)北部荒漠與半荒漠地區(qū)，以寧夏、甘肅、青海、新疆及內(nèi)蒙古為多，種群生長(zhǎng)茂盛［2］?？喽棺右吧Y源豐富，用途廣泛，不僅是優(yōu)良抗鹽堿和固沙植物，還是重要的藥用植物資源，具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。苦豆子味苦、性寒、有毒，具有清熱解毒，抗菌消炎、止痛殺蟲等作用［3-4］，含有生物堿、黃酮等多種化學(xué)成分［5］。中獸藥制劑的質(zhì)量直接影響著其在使用時(shí)的有效性和安全性，建立科學(xué)可行的質(zhì)量控制體系對(duì)中獸藥制劑的研發(fā)甚至中獸藥事業(yè)的發(fā)展具有重要的意義［6］。因此，建立完善的苦豆子灌注劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。

1　材料與方法

1.1材料

美國(guó)Agilent色譜儀包括1290LC色譜工作站、G4212A檢測(cè)器、G1316C柱溫箱、G42226A自動(dòng)進(jìn)

樣器、G4220B二元泵，PHS-3C型精密pH計(jì)，KH-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），苦豆子灌注液（本實(shí)驗(yàn)室自制），槐定堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110784-201306），硅膠板試劑（青島海洋化工廠，批號(hào)20130411）甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

1.2方法

1.2.1鑒別

1.2.1.1性狀 本品為棕褐色、味微苦的液體，裝于灌注器中，每管20mL。

1.2.1.2鑒別方法 精密量取本品1mL置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱并揮干水分后，用氯仿溶解過(guò)濾，并定容于100mL容量瓶中作為供試液。精密稱取槐定堿對(duì)照品10mg，用氯仿溶解并定容于10mL容量瓶中作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010年版第二部附錄V B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-濃氨水（5∶0.6∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液顯色，觀察結(jié)果。

1.2.2槐定堿含量測(cè)定

1.2.2.1色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18 （4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇，3mL/L磷酸（70∶30），檢測(cè)波長(zhǎng)為205nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL，理論塔板數(shù)不低于5 000，在此條件下，槐定堿與其他組分能達(dá)到較好的分離。

1.2.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槐定堿10.0mg，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，配成1mg/mL的溶液。

1.2.2.3供試品溶液的制備 從5支灌注劑中各取1mL，分別置于蒸發(fā)皿中，水浴加熱，揮干水分，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，作為供試品溶液；純甲醇作為空白溶液。

1.2.2.4線性關(guān)系考察 精密吸取槐定堿對(duì)照品溶液2、1.6、1.2、0.8、0.4mL置于2mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，槐定堿對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)作圖，得線性回歸方程。

1.2.2.5精密度試驗(yàn) 按上述色譜條件，以濃度為0.4mg/mL的槐定堿標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣5次，每次5μL，以峰面積計(jì)算RSD。

1.2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)20130612樣品6份，按供試品溶液的制備方法處理，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積與RSD。

1.2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)20130612樣品，按供試液制備方法處理，分別于不同時(shí)間（1、2、3、4、5、6、7、8h）測(cè)定，測(cè)得峰面積，計(jì)算RSD。

1.2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一批樣品（批號(hào)：20130612）1mL，共5份，按供試品溶液制備方法制取，分別精密加入槐定堿的對(duì)照品0.5mg，測(cè)定槐定堿含量，計(jì)算回收率。

1.2.2.9樣品測(cè)定 取本品3批不同批號(hào)的樣品各1mL，按供試品溶液的處理方法處理，測(cè)定計(jì)算樣品含量。

1.2.3初步穩(wěn)定性試驗(yàn) 取3批樣品（20130610、20130612、20130614）置于37℃，相對(duì)濕度75%（飽和氯化鈉溶液）環(huán)境下貯存。以當(dāng)月考察為0月，以后每月考察1次，連續(xù)考察3個(gè)月。與試驗(yàn)開始時(shí)比較，各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯變化，表明苦豆子灌注劑在此條件下質(zhì)量穩(wěn)定。

2　結(jié)果

2.1TLC結(jié)果

供試品溶液所顯示斑點(diǎn)的位置和顏色與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同，Rf值為0.67?；倍▔A的TLC見圖1。

圖1　TLC色譜圖Fig.1 TLC chromatogram

2.2槐定堿含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1色譜圖 結(jié)果見圖2和圖3。

2.2.2線性關(guān)系考察結(jié)果 線性回歸方程為y= 10 991x-4.666 3（r=0.999 6，n=5），結(jié)果表明，對(duì)照品在0.2mg/mL～1.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖4）。

2.2.3精密度試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)照品溶液RSD為0.75%，表明該方法精密度良好。

圖2　槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品Fig.2 The chromatogram of Sophoridine standard

圖3　樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of sample

圖4　槐定堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of sophoridine

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 6份樣品溶液的峰面積平均值為7 162.2，RSD為1.12%。結(jié)果表明該測(cè)試方法的重復(fù)性良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 20130612樣品RSD為0.56%（n=8），表明樣品制備后8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1，平均回收率為98.84%（n=6），RSD為0.338%，表明該法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高。

2.2.7樣品含量測(cè)定結(jié)果 批號(hào)20130610、20130612、20130614樣品含量分別為131.53、130.58、133.03mg/mL。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，暫定本品1mL含槐定堿不得低于120mg（表2）。

表1　苦豆子灌注劑加樣回收率結(jié)果Table 1 Recovery rate of Sophora alopecuroides perfusate

表2　苦豆子灌注劑中槐定堿的含量Table 2 The content of sophoridine in Sophora alopecuroides perfusate

3　討論

取適宜濃度的槐定堿對(duì)照品在190nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果槐定堿在205nm有最大吸收。因此，選用205nm作為槐定堿檢測(cè)波長(zhǎng)。苦豆子總堿中以槐定堿居多，含量為32.63%［5］，而本制劑所用苦豆子總堿中，槐定堿含量高達(dá)65%，因此，選用槐定堿作為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的考察指標(biāo)。

在高效液相測(cè)定含量時(shí)，參照相關(guān)文獻(xiàn)，先后用NH2柱，以乙腈-無(wú)水乙醇-pH2磷酸水溶液（80∶10∶10）為流動(dòng)相［7］，用C18柱，以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀梯度洗脫［8］，以1mL/L冰醋酸水溶液-甲醇（90∶10）為流動(dòng)相［9］，以甲醇-水-三乙胺（55∶45∶0.2）為流動(dòng)相［10-11］，以乙腈-含2.0mL/L三乙胺的0.05mol/L的磷酸二氫鉀溶液（90∶10）為流動(dòng)相［12-13］，以1 mL/L冰醋酸水溶液（三乙胺調(diào)pH5.5）-甲醇（90∶10）［14］等均不能達(dá)到很好的分離效果。而選用甲醇：2mL/L磷酸水溶液（70∶30）為流動(dòng)相，槐定堿色譜峰能夠完全分離，分離度大于1.5，且陰性樣品無(wú)干擾。

綜上所述，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于苦豆子灌注劑的質(zhì)量控制方法。

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Quality Detection of SophoraalopecuroidesPerfusate

XIN Ren-sheng，LIU Yu，LIANG Jian-ping
（Key Laboratory of New Animal Drug Project，Gansu province/Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Discovery，
Ministry of Agricultural/Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS，Lanzhou，Gansu，730050，China）

Abstract：To establish quality standard of Sophora alopecuroides perfusate，TCL and HPLC methods were used for qualitative identification and quantitative determination of sophridine.Sophoridine content was determined by RP-HPLC.TLC spots of sophoridine was same to that of Sophora alopecuroides perfusate in terms of color and site；the method was specific and TLC spots were well-separated.The linear ranges of sophridine and oxymatrine were 0.2 mg/mL-1 mg/mL（r=0.999 7），and average recovery rate was 98.84%（RSD=0.338%，n=6）.The results showed that the method is proved to be simple，reproducible and can be used for quality control of the preparation.

Key words：Sophora alopecuroides perfusate；sophoridine；quality standard；TLC；HPLC

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：辛任升（1987-），男，山東青島人，碩士，主要從事中草藥開發(fā)與利用研究。＊

基金項(xiàng)目：“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011AA10A214）

收稿日期：2014-11-04

中圖分類號(hào)：S853.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0055-04