鄭　言，宋戰(zhàn)昀，楊　倩，王向輝，隋佳辰，張　健，王振國，李敏思（.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春08；.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春006；.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅蘭州70070）

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蜜蜂殘翼病病毒PCR檢測及5′-UTR 基因序列分析

鄭言1，宋戰(zhàn)昀2＊，楊倩1，王向輝1，隋佳辰1，張健1，王振國2，李敏思3
（1.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春130062；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅蘭州730070）

摘 要：從吉林省某蜂場疑似蜜蜂殘翼病病料中分離到一株蜜蜂殘翼病病毒（DWV），命名為DWVJL1，提取該分離株的總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴增其基因組的5′-UTR并測序。測序結(jié)果與GenBank公布道的DWV 5′-UTR序列同源性在95%～99%之間。將測序結(jié)果與GenBank上公布的9個相關(guān)序列進行系統(tǒng)遺傳進化樹分析，證實其與JX878304同源性最近，而與GU109335、KJ437447同源性最遠。

關(guān)鍵詞：蜜蜂殘翼病病毒；5′-UTR；克隆和測序分析

蜜蜂殘翼病病毒（Deformed wing virus，DWV）為正股小RNA病毒，能引起蜜蜂翅膀的殘缺以及成年蜜蜂的死亡。DWV感染一般呈隱性過程［1］。已經(jīng)證明DWV可感染蜂王的卵巢和雄蜂的儲精囊，使蜂王產(chǎn)下帶病毒的卵，將病毒從親代傳給子代［2］。DWV如果只寄生在蜜蜂的胸部和腹部，一般不會出現(xiàn)任何癥狀，但病毒若進入蜜蜂的頭部并大量復制，就會出現(xiàn)畸翅癥狀。DWV最初于20世紀80年代從日本分離得到，現(xiàn)已分布廣泛，在歐洲、北美、南美、非洲、亞洲和中東均有發(fā)現(xiàn)。DWV能夠以低濃度隱性感染方式長期傳播于蜂群中，被瓦螨激活后，在宿主體內(nèi)迅速復制，表現(xiàn)出較強的感染性，最終導致蜂群衰落［3］。因此，加快對DWV致病機制的研究，有助于蜜蜂殘翼病的防控，降低養(yǎng)蜂業(yè)的經(jīng)濟損失。

DWV屬于傳染性軟化病病毒科（Iflaviridae）、傳染性軟腐病病毒屬（Iflavirus），為單股、正鏈RNA病毒，基因組為單順反子，病毒直徑約為30 nm，形狀為二十面體。基因組結(jié)構(gòu)包括一個大的、連續(xù)的開放閱讀框（open reading frame，ORF），5′端有一個長的非翻譯區(qū)域（5′-UTR）。由于DWV基因組5′端沒有帽子結(jié)構(gòu)，影響核糖體對mRNA的識別，但5′-UTR有一個內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES），能夠啟動翻譯，因此5′-UTR對基因組的翻譯和復制調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用［4-5］。本研究采用RT-PCR，成功從疑似蜜蜂殘翼病病料中擴增出DWV的5′-UTR基因并對該基因片段進行了分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 采自吉林地區(qū)蜂場疑似DWV感染的蜜蜂。

1.1.2試劑 Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）、dNTPs、10×buffer緩沖液、NA Marker DL 2 000，pMD18-T載體，大腸埃希菌DH5α，cDNA Sythesis Kit，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；PCR引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒，康寧生命科學（吳江）有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨，酵母浸出物為Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器 3K30高速冷凍離心機，德國Sigma公司產(chǎn)品；Gene SpecV核酸蛋白分析儀，日本Hitachi NaKa instruments Co.，Ltd.公司產(chǎn)品；Biometra Tgradient-96PCR擴增儀，德國Biometra公司產(chǎn)品；PS500A電泳儀，美國Sacant公司產(chǎn)品；生化恒溫培養(yǎng)箱、0.1μL～1 000μL微量移液器，芬蘭Biohit公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1RT-PCR擴增 將疑似DWV感染的蜜蜂病料加入適量PBS充分研磨，取上250μL上清液加入DEPC處理的1.5mL EP管，再添加750μL氯仿，劇烈搖晃20 s后室溫靜止10 min；12 000r/min、4℃離心10min；吸取600μL上清轉(zhuǎn)移至另一新的DEPC處理過的1.5mL離心管，加入事先預(yù)冷的異丙醇溶液300μL，-20℃放置

30min；12 000r/min、4℃離心10 min；棄掉上清液，加入1mL 750mL/L的冰乙醇溶液吹打混勻；7 500r/min、4℃離心5min，棄掉上清液，室溫干燥5min；加入20μL DEPC水溶解沉淀，最終得到的即為總RNA。

以獲得的病毒總RNA為模版，用RTase cDNA Sythesis Kit合成cDNA，保存于-70℃?zhèn)溆?。參照GenBank中公布的DWV Korea-1毒株mRNA序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計一對引物，預(yù)期擴增片段大小為910bp，上游引物P1：5′-AGCGAATTACGGTGCAACTAACAAT-3′，下游引物P2：5′-GCCATCGTCTGGGCTATGAGACATT-3′。

以P1（上游引物）、P2（下游引物）、cDNA為模板進行PCR擴增。具體體系為2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL dNTP，1.0μL P1，1.0μL P2，0.5 μL Ex Taq酶，1.0μL cDNA，17μL RNase free H2O。擴增條件為：95℃3min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物采用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2RT-PCR擴增產(chǎn)物的克隆及鑒定 按試劑盒說明書用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，涂在LB培養(yǎng)板上過夜培養(yǎng)，挑取單個白色菌落，放入含5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，150r/min搖床培養(yǎng)16h，培養(yǎng)液混濁后采用AxyPrep質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取質(zhì)粒。將采用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定為陽性克隆的送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pT-5′-UTR。

1.2.3RT-PCR擴增產(chǎn)物測序及基因系統(tǒng)遺傳進化樹分析 用Mega5分析軟件中的Clustal W程序進行多重序列對齊分析，使用鄰接法（Neighborjoining method）的Kimura′s 2-parameter model方法重復1 000次構(gòu)建進化樹。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴增結(jié)果

利用設(shè)計的特異性引物，從病毒總RNA中采用RT-PCR方法成功擴增到一段長約900bp的片段（圖1），其大小與預(yù)期大小一致。

2.2克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，證實重組克隆質(zhì)粒pT-5′-UTR構(gòu)建成功（圖2）。

2.3RT-PCR擴增產(chǎn)物測序及基因系統(tǒng)遺傳進化樹分析結(jié)果

將重組質(zhì)粒pT-5′-UTR送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，結(jié)果顯示該片段大小為916bp，序列如圖3所示，將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast比對，該核苷酸序列與搜索到的其他DWV 5′-UTR基因同源性在95%～97%之間，因此證實了得到的序列為DWV 5′-UTR核苷酸序列。將上述測序結(jié)果與GenBank上公布的9個DWV全基因組進行比較，9個毒株的GenBank序列號分別為NC004830、AJ489744、JQ413340、AY292384、GU109335、KJ437447、AB070959、JX878304、JX878305。用Mega5分析軟件中的Clustal W程序進行多重序列對齊分析使用鄰接法（Neighbor-joining method）的Kimura′s 2-parameter model方法重復1 000次構(gòu)建進化樹如圖4所示。從圖中可以看出該基因核苷酸序列與JX878304株同源性最近，而與GU109335、KJ437447同源性最低。

圖1　DWV基因cDNA PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of DWV cDNA

圖2　DWV基因克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of DWV cloning plasmid by enzyme digestion

圖3　DWV-JL1分離株的核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of 5′-UTR gene of DWV-JL1

圖4　DWV 5′-UTR基因系統(tǒng)遺傳進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 5′-UTR gene of DWV-JL1

3　討論

DWV可侵染各發(fā)育階段的蜜蜂，在蛹期危害不明顯，羽化后出現(xiàn)翅膀殘缺并迅速死亡；成年蜜蜂發(fā)病后翅膀畸形、腹部萎縮和褪色。呈隱性感染的蜜蜂雖然無明顯臨床癥狀但其壽命也會縮短［6］。臨床發(fā)現(xiàn)在瓦螨暴發(fā)的蜂群中DWV的滴度最高，而在無瓦螨或少量瓦螨存在的蜂群中DWV的滴度較低，因此DWV與傳播媒介瓦螨間關(guān)系備受關(guān)注［7］。近年來的研究表明DWV是引發(fā)“蜂群崩潰失調(diào)癥”（Colony collapse disorder，CCD）的主要病毒之一，DWV在全球范圍的流行已成為蜜蜂蜂群非正常消失的一個重要原因［8-10］。

本研究從吉林地區(qū)分離到一株DWV毒株，經(jīng)RT-PCR得到DWV 5′-UTR基因序列，并與Gen-Bank上報道的DWV序列進行遺傳進化樹分析。通過對吉林地區(qū)DWV分離株的5′-UTR研究表明，5′-UTR有一個內(nèi)部核糖體進入位點（IRES），IRES能夠在細胞內(nèi)的一些反式作用因子的輔助下招募核糖體小亞基對mRNA進行翻譯，因此，5′-UTR對基因組翻譯和復制調(diào)節(jié)非常重要。IRES不僅存在于RNA病毒中，在很多DNA病毒中也頻繁出現(xiàn)，且在哺乳動物、植物以及酵母中均發(fā)現(xiàn)了IRES序列存在。盡管IRES的結(jié)構(gòu)仍未闡明，但其基本組成已經(jīng)被認定分布在ORF前300個核苷酸內(nèi)［1］，其他傳染性軟腐病病毒屬、微小核糖核酸病毒（Picornaviruses）和雙順反子病毒（Dicistroviruses）的5′-UTR也被證實存在IRES。通過對5′-UTR的研究有助于了解DWV基因組翻譯和復制調(diào)節(jié)機制，對DWV的防控有一定的積極意義。

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PCR Detection of Deformed Wing Virus and Sequence Analysis of 5′-UTR Gene

ZHENG Yan1，SONG Zhan-yun2，YANG Qian1，WANG Xiang-hui1，SUI Jia-chen1，ZHANG Jian1，WANG Zhen-guo2，LI Min-si3
（1.Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin，130118，China；2.Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changchun，Jilin，130062，China；3.Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu，730070，China）

Abstract：A strain of deformed wing virus was isolated from suspected deformed wing virus disease materials in an apiary of Jilin and was named DWV-JL1.Total RNA was extracted from the isolate and a fragment of 5′-UTR gene was amplified by RT-PCR.The sequencing results showed that 5′-UTR had high homology about 95%-99%compared with the report in GenBank.According to the phylogenetic tree based on 5′-UTR，we confirmed that it had the highest homology with JX878304and the lowest homologies with GU109335and KJ437447.

Key words：Deformed wing virus；5′-UTR；cloning and sequence analysis

通訊作者

作者簡介：鄭 言（1988-），男，吉林人，碩士研究生，主要從事蜜蜂病毒研究。＊

基金項目：國家自然科學 （31001065）；質(zhì)檢總局科技項目（2013IK033）

收稿日期：2014-08-29

中圖分類號：S895.9

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0052-04