楊金平，沐建剛，劉　岳，和　錦，仁仕明，劉旭川，張以芳，畢保良＊（.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)驗(yàn)中心，云南昆明6500；.云南省峨山縣水產(chǎn)工作站，云南峨山6500；.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明6500）

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羅非魚維羅納氣單胞菌的分離鑒定

楊金平1，沐建剛2，劉岳1，和錦1，仁仕明1，劉旭川1，張以芳3，畢保良3＊
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)驗(yàn)中心，云南昆明650201；2.云南省峨山縣水產(chǎn)工作站，云南峨山653200；
3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，云南昆明650201）

摘 要：為了解云南某漁場(chǎng)羅非魚大量死亡的原因，通過病原分離純化，表型鑒定及16SrRNA測(cè)序分析，從發(fā)病和瀕死魚中分離純化了4株革蘭陰性桿菌（Av1、Av2、Av3、Av4），其培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、生化特征與維羅納氣單胞菌相同；用PCR方法擴(kuò)增4株純化菌的16SrRNA基因，得到大小相同的片斷，選取條帶明亮的Av3進(jìn)行16SrRNA測(cè)序分析，與GenBank中的維羅納氣單胞菌B565株核苷酸同源性為100%。用核苷酸同源性99%以上的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Av3與運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌聚類。綜合動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果，確定維羅納氣單胞菌（Aeromonas veronii）是導(dǎo)致該漁場(chǎng)羅非魚大量死亡的主要病原之一。

關(guān)鍵詞：羅非魚；維羅納氣單胞菌；分離；鑒定

2013年9月，云南省某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)羅非魚大量死亡。病魚發(fā)病期離群獨(dú)游，體表鱗片脫落，鰭基發(fā)紅，部分病魚出現(xiàn)蛀鰭現(xiàn)象，眼球突出，肛門紅腫，少數(shù)魚無(wú)明顯癥狀就死亡。剖檢可見病魚腸道嚴(yán)重充血，有黃色黏液，腸壁薄脆。肝、脾、腎嚴(yán)重潰爛。從不同的病魚和瀕死魚體分離到4株溶血性細(xì)菌。現(xiàn)將分離鑒定結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料 病料采自云南省某地羅非魚（體重0.5 kg～0.7kg）養(yǎng)殖場(chǎng)的患病魚。健康羅非魚購(gòu)自元陽(yáng)羅非魚種苗場(chǎng)，經(jīng)14d觀察飼養(yǎng)正常后，用于感染試驗(yàn)。

1.1.2培養(yǎng)基及試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，鮮血瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，MR試劑，VP試劑，吲哚試劑等均為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室配制［1-2］；細(xì)菌生化鑒定微量反應(yīng)管為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒（離心柱型）為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；PCR反應(yīng)體系（10×Taq buffer、dNTP Mixture（2.5mmol/L each）、Taq（2.5U/μL）、ddH2O）為北京莊盟國(guó)際生物有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌16SrDNA基因通用引物F1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3′和R1：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′為寶生物工程（大連）技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離純化 無(wú)菌采取發(fā)病和瀕死羅非魚的腹腔液及肝、脾、腎［3-9］，劃線分離于鮮血瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂各兩份，30℃24h需氧及厭氧培養(yǎng)后觀察菌落生長(zhǎng)，革蘭染色、鞭毛染色［10-11］，觀察菌體形態(tài)和染色特性。將可疑菌落轉(zhuǎn)接于試管斜面純培養(yǎng)。

1.2.2生理生化鑒定 根據(jù)菌體的培養(yǎng)特性、染色特性，用18h的純培養(yǎng)物，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行葡萄糖、乳糖、半乳糖，蔗糖、果糖、鼠李糖、麥芽糖、棉子糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、七葉苷、甘露醇、硫化氫、尿素、明膠液化、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、硝酸鹽還原、VP、MR、呼吸型、氧化酶和接觸酶試驗(yàn)［12-13］。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定 將分離獲得的4個(gè)菌株分別接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，30℃振蕩培養(yǎng)過夜，取1.5mL液菌，12 000r/min離心2min，收集菌體。按照試劑盒操作說明提取細(xì)菌基因組DNA，以其模板進(jìn)行16SrDNA基因PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10 ×Taq buffer 5μL，dNTP Mixture（2.5mmol/L each）4μL，Taq（2.5U/μL）1μL，ddH2O 33μL，上、下游引物各2μL（10mol/L），模板DNA 3μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃30s，53℃40s，72℃45s，35

個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。將擴(kuò)增條帶明亮的PCR產(chǎn)物用DNA回收試劑盒回收，送華大生物科技有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果通過NCBI的Blast進(jìn)行序列同源性比較，選取參比菌株，使用MEGA6.0軟件，運(yùn)用Neighbour-Joining方法，采用Kimura 2-parameter校正模型，自舉1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并分析。

1.2.4動(dòng)物回歸試驗(yàn) 4個(gè)分離菌株分別接種至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，30℃下24h培養(yǎng)，用無(wú)菌生理鹽水將平板上的菌苔洗下，制成菌懸液，平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度［8］，無(wú)菌生理鹽水將菌液稀釋并調(diào)整為5.4×1012CFU/mL備用［13-14］。約75g的50尾羅非魚隨機(jī)分為5組，每組10尾，分別飼養(yǎng)于180L水魚缸中，1組～4組接備用菌液各5mL，接種終濃度為1.5×107CFU/mL，第5組加培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。接種后觀察魚的發(fā)病死亡情況，對(duì)死魚及時(shí)剖檢，并對(duì)致病菌再次分離鑒定。

2　結(jié)果

2.1病原菌的分離

各檢樣在3種培養(yǎng)基中需氧及厭氧培養(yǎng)，均有菌落形成，且形態(tài)單一。鮮血瓊脂平板上呈β溶血的圓形、光滑、濕潤(rùn)、淡黃色落菌（圖1）。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈圓形、光滑、濕潤(rùn)的白色小菌落。麥康凱瓊脂平板上圓形、光滑、濕潤(rùn)的淡黃色小菌落。分離純化的4株細(xì)菌經(jīng)革蘭染色，鏡檢可見兩端鈍圓、小桿狀、無(wú)莢膜、無(wú)芽胞（圖2）、多呈單個(gè)排列。鞭毛染色，為極生鞭毛，有運(yùn)動(dòng)力（圖3）。

圖1　Av3β溶血菌落特征Fig.1 The characteristics of Av3β-hemolytic colonies

圖2　Av3革蘭染色鏡檢（1 000×）Fig.2 Gram stain of strain Av3（1 000×）

2.2分離菌株的生化鑒定

各菌株的氧化酶、接觸酶、MR、VP試驗(yàn)均為陽(yáng)性，分解葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、七葉苷、甘露醇、淀粉，尿素、液化明膠，還原硝酸鹽，不發(fā)酵山梨糖、木糖、阿拉伯糖、棉籽糖、鼠李糖、乳糖、山梨醇、不產(chǎn)生硫化氫，分離到的菌株Av1、Av2、Av3、Av4均符合維羅納氣單胞菌的特性［14-19］（表1）。

圖3　Av3鞭毛染色（改良Leifson染色法，1 000×）Fig.3 Av3flagella stain（Leifson stain，1 000×）

2.3分離菌株的16SrRNA鑒定

以Av1、Av2、Av3、Av4的DNA為模板，通過16S rRNA通用引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在1 000bp ～2 000bp之間，條帶單一、大小相同（圖4）。選擇條帶濃度最高的Av3擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，經(jīng)測(cè)序得到長(zhǎng)度為1 442bp。將其基因序列在Blast T進(jìn)行同源性比較，依據(jù)MGGA6.0軟件同源性檢索結(jié)果，選取同源性99%以上的檢索序列做為參比菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示Av3菌株與維羅納氣單胞B565親緣關(guān)系最近，自然聚為一支。與不同菌種的Aeromonas bestiarum（CIP74.30）、Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes（6263/4/5）、Haemophilus piscium（CIP 106116）、Aeromonas salmonicida subsp.masoucida（JCM 7873）分支進(jìn)化距離較遠(yuǎn)（圖5）。從分子水平上進(jìn)一步證實(shí)分離細(xì)菌為維羅納氣單胞菌。

2.4動(dòng)物回歸試驗(yàn)

4個(gè)菌株（5.4×1012CFU/mL）均能在12h內(nèi)引起發(fā)病，且72h致死率達(dá)100%，對(duì)照組羅非魚未見異常，表明Av1、Av2、Av3、Av4對(duì)羅非魚具有致死性。對(duì)接種菌液的魚進(jìn)行觀察，發(fā)病癥狀及死后剖解癥狀均與自然病例相同，且從肝、脾、腎及腹腔液重新分到相同的病原菌（表2）。

圖4　細(xì)菌株Av1～Av4 16SrRNA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of Av1-Av4 16SrRNA gene

表1　4個(gè)分離菌株的生化特性鑒定Table 1 Biochemical identification of 4bacterial isolates

圖5　Av3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of Av3strain

表2　分離菌對(duì)羅非魚的人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of pathogenicity test of isolates in tilapia

3　討論

根據(jù)形態(tài)學(xué)、理化特性、16SrRNA測(cè)序分析和人工回歸感染試驗(yàn)，確定導(dǎo)致漁場(chǎng)羅非魚大量死亡的病原菌為維羅納氣單胞菌，提示該菌在水產(chǎn)動(dòng)物中的病原學(xué)意義。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，發(fā)育樹由兩個(gè)分支構(gòu)成，上支由非運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌組成；下支由運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌，是水生動(dòng)物尤其是魚類最常見的致病菌，在水溫高的夏季可造成暴發(fā)性流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前在國(guó)外已將這個(gè)分支中的嗜水氣單胞菌納入腹瀉病原菌的常規(guī)檢測(cè)范圍，是食品衛(wèi)生檢驗(yàn)對(duì)象。

由于水產(chǎn)生存環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，水產(chǎn)病害也是綜合因素所導(dǎo)致，在該病例暴發(fā)的時(shí)候。8月份高溫干旱、晝夜溫差大，使魚體抗病力下降，9月

份降雨增加，雨水導(dǎo)致泥沙沖刷或底泥翻起，導(dǎo)致的病原菌在水體魚群分布層增加，水體含較豐富的鹽離子和溶解態(tài)有機(jī)質(zhì)，有利于病原微生物的生長(zhǎng)和疾病的發(fā)生。人工感染回歸試驗(yàn)?zāi)M了水生動(dòng)物所處的自然環(huán)境變化。采取直接倒入致病菌菌液的方法，與浸泡感染、劃破皮膚浸泡感染、背鰭部注射感染、菌液接種肌肉感染和腹腔注射感染相比較，減少了對(duì)水生動(dòng)物的應(yīng)激損傷及試驗(yàn)工作時(shí)間。

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Isolation and Identification of Aeromonas veronii in Tilapia

YANG Jin-ping1，MU Jian-gang2，LIU Yue1，HE Jin1，REN Shi-ming1，LIU Xu-chuan1，ZHANG Yi-fang3，BI Bao-liang3
（1.Experimental Teaching Center for Agricultural Course，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan，650201，China；2.Eshang County Fishery Station，Eshan，Yunnan，653200，China；3.College of Animai Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan，650201，China）

Abstract：To confirm the cause of massive death happened in a tilapia farm in Yunnan province，samples were collected from diseased tilapia，and the bacterial isolation，purification，phenotypic identification and 16SrRNA sequencing analysis were conducted.Study results showed that 4strains of Gram negative bacilli（Av1，Av2，Av3，Av4）were isolated，which similar to Aeromonas veronii in cultural traits，mycelial morphology and biochemical characters.In addition，16SrRNA genes of the 4purified strains were amplified by PCR method and amplified fragments were sequenced，the nucleotide homology analysis results found that Av3and Aeromonas veronii strain B565share identical 16SrRNA genes.Phylogenetic tree were constructed by selected strains，and sequences share 99%or more nucleotide homology from GenBank，and Av3was clustered with Aeromonas.Combination with results of experimental infection of tilapia with four isolated bacilli，the cause of outbreak was identified as Aeromonas veronii infection.

Key words：tilapia；Aeromonas veronii；isolation；identification

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：楊金平（1991-），男（白族），云南蘭坪人，本科，主要從事動(dòng)物檢疫研究。＊

基金項(xiàng)目：云南省教育廳科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2012Z023）

收稿日期：2014-07-15

中圖分類號(hào)：S852.61

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0040-04