許家園，程　田，胡會朋，陳曉珍，翁亞彪，林瑞慶（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

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兔腸艾美耳球蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法的建立

許家園，程田，胡會朋，陳曉珍，翁亞彪，林瑞慶
（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

摘 要：為建立一種腸艾美耳球蟲定量的檢測方法，在腸艾美耳球蟲核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，以10倍倍比稀釋的已知卵囊含量的腸艾美耳球蟲DNA為模板進(jìn)行SYBR GreenⅠreal-time PCR的擴(kuò)增和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。結(jié)果顯示，最低可檢測1個(gè)卵囊含量的樣品，與同屬的黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲均不發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性變異系數(shù)小于2%。表明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，可為快速檢測腸艾美耳球蟲提供有效的方法。

關(guān)鍵詞：兔；腸艾美耳球蟲；SYBR GreenⅠ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

兔球蟲病是由艾美耳屬球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種最常見的原蟲性疾病，該病流行廣泛［1-2］，對不同年齡段的兔均有不同程度的危害，嚴(yán)重影響?zhàn)B兔業(yè)的健康發(fā)展［3］。國際上公認(rèn)的兔艾美耳球蟲有11個(gè)種［4］，其中腸艾美耳球蟲是3種強(qiáng)致病性兔球蟲蟲種之一，能引起嚴(yán)重的球蟲病。因此，開展對該病病原的檢測對其防控有重要的意義。

長期以來，對球蟲病的診斷主要依靠傳統(tǒng)的卵囊形態(tài)、致病性、寄生部位、腸道病變特征等指標(biāo)［5］，近年來普通PCR也逐漸用于兔球蟲的檢測［6-7］，促進(jìn)了兔球蟲的分子鑒定研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time PCR）具有重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)［8］，近年來國外不少學(xué)者將此方法用于檢測臨床寄生蟲的感染，Morgan J A T等［9-10］建立了7種雞球蟲的real-time PCR檢測方法，可以準(zhǔn)確的檢測出多價(jià)雞球蟲活疫苗中的各種球蟲的卵囊含量，對臨床雞糞便中的卵囊檢測可以精確到1個(gè)卵囊。但目前未見熒光定量檢測方法應(yīng)用于兔球蟲的臨床研究。因此，本試驗(yàn)擬建立一種兔腸艾美耳球蟲real-time PCR檢測方法，為腸艾美耳球蟲病的快速診斷和定量檢測提供技術(shù)手段。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲種來源 腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲純種卵囊均由佛山正典生物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2主要試劑 DNA提取試劑盒Wizard SV Genomic DNA Purification System購置于Promega公司。蛋白酶K購置于Merck公司。SYBR Green Premix Ex TaqⅡ、Ex-Taq DNA聚合酶、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL-500DNA Size Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中腸艾美耳球蟲ITS2序列，用Primer 5.0設(shè)計(jì)一對特異性引物，上游引物F：5′-TTGTTCAATGCTGTTGCCGA -3′，下游引物R：5′-CCTCATCTTTCCACCACCGT -3′，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段160bp，引物由華大基因公司合成。

1.2.2腸艾美耳球蟲卵囊DNA提取 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)純種保存的腸艾美耳球蟲卵囊液，用移液槍吸取含106個(gè)卵囊的卵囊液于1.5mL離心管中，加入1mL雙蒸水，13 000r/min離心10min，棄上清液，重復(fù)兩次。加入與卵囊體積相同的玻璃珠，持續(xù)漩渦震蕩，在顯微鏡下觀察直到95%的卵囊壁破裂后，按Promega試劑盒Wizard SV Genomic DNA Purification System使用說明進(jìn)行DNA提取，提取后的DNA于-20℃保存。

1.2.3Real-time PCR反應(yīng)體系與條件 反應(yīng)體系為20μL，其中SYBR Green Primix Ex TaqⅡ10

μL，上下游引物（25pmol/μL）各0.25μL，模板DNA 2μL，dd H2O 7.5μL；反應(yīng)條件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，72℃30s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完成繪制熔解曲線。

1.2.4Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將提取的DNA原液做1∶10～1∶105倍比稀釋，得到5個(gè)梯度的DNA樣品相當(dāng)于卵囊數(shù)分別為105、104、103、102、101所提取得到的DNA，將這5個(gè)梯度的DNA樣品進(jìn)行real-time PCR，反應(yīng)體系和條件同上，根據(jù)real-time PCR的動力學(xué)曲線，檢測儀系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線以及回歸方程。

1.2.5Real-time PCR特異性試驗(yàn) 分別提取黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲DNA，用所建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR進(jìn)行檢測，收集熒光信號，檢測其特異性，同時(shí)設(shè)腸艾美耳球蟲陽性對照組和無模板陰性對照。

1.2.6敏感性試驗(yàn) 將DNA原液做1∶10～1∶106倍比稀釋，用所建立的real-time PCR進(jìn)行檢測，并將此6種稀釋度的DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，電泳觀察結(jié)果，比較兩種方法的靈敏度。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 將DNA原液做1∶10～1∶105倍比稀釋后進(jìn)行3次組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)。組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：5個(gè)稀釋度的樣品DNA，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)進(jìn)行real-time PCR檢測；組間重復(fù)試驗(yàn)：將5個(gè)稀釋度的樣品DNA在不同的時(shí)間做3次real-time PCR檢測。根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算Ct平均值和變異系數(shù)（CV），評價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以1∶10～1∶105倍比稀釋DNA原液形成的5個(gè)梯度DNA作為模板進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，得到動力學(xué)擴(kuò)增曲線（圖1），用Rotor Gene Q軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以稀釋后的DNA所代表的卵囊個(gè)數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。圖1顯示，模板Ct值與該模板DNA對應(yīng)的卵囊個(gè)數(shù)存在線性關(guān)系，卵囊數(shù)越高對應(yīng)的Ct值越小。該直線的斜率為-3.563 8，截距為32.548 9，R2為0.997，擴(kuò)增效率為95%，從而得出標(biāo)準(zhǔn)方程：y=-3.548 9logx+32.548 9。real-time PCR溶解曲線顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度為83℃，未見非特異性擴(kuò)增和引物二聚體生成（圖3）。

2.2特異性試驗(yàn)

用所建立的real-time PCR方法對腸艾美耳球蟲、黃艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和大型艾美耳球蟲進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，除腸艾美耳球蟲的檢測結(jié)果為陽性外，其他種球蟲的檢測結(jié)果均為陰性（圖4），表明該方法檢測腸艾美耳球蟲具有良好的特異性。

圖1　腸艾美耳球蟲real-time PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線Fig.1 Dynamic curve of E.intestinalis real-time PCR

圖2　腸艾美耳球蟲real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of E.intestinalis real-time PCR

圖3　腸艾美耳球蟲擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線Fig.3 The melting curve of amplication products of E.intestinalis

圖4　real-time PCR特異性擴(kuò)增曲線Fig.4 The specific amplication curve of real-time PCR

2.3敏感性試驗(yàn)

將DNA原液做1∶10～1∶106倍比稀釋后進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，分析其敏感性，圖5顯示6個(gè)稀釋度的樣品DNA都得到了有效的擴(kuò)增，結(jié)果表明該方法最低可對106倍稀釋的DNA進(jìn)行檢測，即可檢測1個(gè)卵囊含量的樣品；普通PCR結(jié)果顯示原始DNA 1∶10～1∶105倍比稀釋能被檢測出，而106倍稀釋后未能被檢測出，即普通PCR可對105倍稀釋的DNA進(jìn)行檢測，可檢測10個(gè)卵囊含量的樣品（圖6）。該real-time PCR靈敏度是普通PCR 的10倍。

圖5　real-time PCR敏感性試驗(yàn)Fig.5 Sensitivity test of real-time PCR

圖6　普通PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 The amplification results of the conventional PCR

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

將原始DNA按1∶10～1∶105倍比稀釋后，進(jìn)行3次組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）為0.1 %～1.0 %（表1），組間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)（CV）為0.8 %～1.9%（表2），均小于2%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1　SYBR GreenⅠreal-time PCR組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Intra-assay reproducibility test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

表2　SYBR GreenⅠreal-time PCR的組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Inter-assay reproducibility test of SYBR GreenⅠreal-time PCR

3　討論

Real-time PCR是一種定量定性的檢測方法，與普通PCR相比，具有靈敏、精確、簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)，PCR的擴(kuò)增及其分析過程均在同一封閉系統(tǒng)下完成，只需加樣時(shí)打開1次PCR反應(yīng)管，避免交叉污染導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，因此被廣泛的應(yīng)用于各種臨床檢測［11］。

SYBR GreenⅠ法成本低、操作簡便，雖然其特異性不如TaqMan探針法，但使用特異性高的引物，優(yōu)化反應(yīng)體系與條件，消除非特異性擴(kuò)增和二聚體的生成，也能達(dá)到很高的特異性［12］。

本研究建立的SYBR GreenⅠreal-time PCR對腸艾美耳球蟲的檢測具有很好的特異性，最低可以檢測1個(gè)卵囊含量的樣品；各個(gè)濃度擴(kuò)增重復(fù)性好，組內(nèi)和組間重復(fù)的變異系數(shù)（CV）均小于2%，穩(wěn)定性好；此方法可以直接對糞便提取的腸艾美耳球蟲DNA進(jìn)行檢測，可以精確的檢測到糞便中的卵囊含量，得到每克糞便中的卵囊含量（OPG），且一次可以對多個(gè)糞樣進(jìn)行檢測，比傳統(tǒng)的顯微鏡檢查更高效精確。該real-time PCR技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感度高、穩(wěn)定性好，可以用于臨床腸艾美耳球蟲感染情況進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測，為該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供一種技術(shù)手段。

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Development of Real-time PCR for Detection of Eimeria intestinalis

XU Jia-yuan，CHENG Tian，HU Hui-peng，CHEN Xiao-zhen，WENG Ya-biao，LIN Rui-qing
（College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong，510642，China）

Abstract：To develop a SYBR GreenⅠreal-time PCR assay to detect Eimeria intestinalis，apair of primers were designed basing on the internal transcribed spacer 2（ITS2）sequence of E.intestinalis.The standard curve was generated by using serial dilutions of E.intestinalis DNA.The result indicated that the assay was highly sensitive with detection limit of one occyst and no cross-reaction with Eimeria flavescens，Eimeria media and Eimeria magna.The results showed that this method was characterized by high sensitivity and spceificity，and could be further used in clinic detection and epidemic investigation of E.intestinalis.

Key words：rabbit；Eimeria intestinalis；SYBR GreenⅠ；real-time PCR

通訊作者

作者簡介：許家園（1988-），男，安徽人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)寄生蟲研究。＊

基金項(xiàng)目：廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012A020100001）

收稿日期：2014-11-06

中圖分類號：S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0036-04