闞松鶴，劉　俠，林　青＊（.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌7200；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧8006）

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一種弓形蟲單管套式PCR 檢測(cè)方法的建立及其在奶山羊應(yīng)用

闞松鶴1，2，劉俠1，林青1＊
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海西寧810016）

摘 要：根據(jù)GenBank上發(fā)表的弓形蟲RH蟲株529bp重復(fù)序列，設(shè)計(jì)內(nèi)、外2對(duì)特異性引物，建立一種弓形蟲單管套式PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)行特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)及奶山羊臨床樣品的檢測(cè)試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法能夠擴(kuò)增出基因片段大小為216bp，與GenBank收錄的相關(guān)序列同源，而與山羊泰勒蟲、微小隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲基因組無(wú)交叉反應(yīng)，該方法能夠檢測(cè)出DNA的最小量為1fg。使用該方法對(duì)137份奶山羊血液樣品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有38份為陽(yáng)性。本研究所建立的方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高的特點(diǎn)，可用于奶山羊弓形蟲病的診斷，有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：529bp重復(fù)序列；弓形蟲；單管套式PCR；弓形蟲??；奶山羊

弓形蟲是一種有核細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲，可寄生于絕大多數(shù)恒溫動(dòng)物體內(nèi)［1］。在眾多易感家畜中，豬、綿羊、山羊是人類感染弓形蟲的主要途徑［2］。山羊妊娠期間首次感染弓形蟲可導(dǎo)致流產(chǎn)、產(chǎn)死胎等臨床癥狀，且目前尚無(wú)特效治療藥物，給養(yǎng)羊業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3-9］，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)弓形蟲感染就顯得極為重要。傳統(tǒng)的弓形蟲檢測(cè)方法，即病原學(xué)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，敏感性低；而血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陰性或由其他原蟲交叉免疫而出現(xiàn)假陽(yáng)性；分子生物學(xué)診斷中，常規(guī)PCR敏感性較低，而套式PCR敏感性、特異性都較高，但與常規(guī)PCR方法相比，操作較為繁瑣且更易污染。為了避免污染、簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，本研究擬以弓形蟲基因組中529bp重復(fù)序列為對(duì)象，建立一種單管套式PCR檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲株與奶山羊血液樣品 剛地弓形蟲RH蟲株DNA由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所張德林研究員饋贈(zèng)。奶山羊血液樣品共137份，采自陜西省關(guān)中地區(qū)某羊場(chǎng)的奶山羊，采血時(shí)加入抗凝劑（肝素）。山羊泰勒蟲、微小隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲等DNA均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 10×PCR buffer、MgSO4、dNTPs、KOD-Plus-Neo為東洋紡生物科技有限公司產(chǎn)品，6× Loading buffer、DNA Marker DL 2 000為寶生物工程（大連）技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.1.3引物設(shè)計(jì) 根據(jù)弓形蟲RH蟲株529bp重復(fù)序列基因（GenBank accession number DQ779191）設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物（表1），引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行合成。

1.2方法

1.2.1奶山羊血液預(yù)處理及弓形蟲DNA的提取

將采集到的奶山羊抗凝血在3 000r/min離心5min，棄上層血清，于血清與紅細(xì)胞交界處吸取200μL血液，加入1.5mL離心管中備用。之后按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行弓形蟲DNA的提取。

1.2.2單管套式PCR反應(yīng)條件 反應(yīng)條件為94℃2 min；94℃15s，68℃60s，15個(gè)循環(huán)；94℃15s，59℃30s，68℃30s，35個(gè)循環(huán)；68℃7min。反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs（2mmol/L）2.5μL，MgSO4（25mmol/L）1.5μL，KOD-Plus-Neo（1U/μL）0.5μL，External primers（250nmol/L）1μL，Internal primers（10μmol/L）1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13 μL，總體積為25μL。

1.2.3特異性試驗(yàn) 分別以山羊泰勒蟲、微小隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲和弓形蟲RH蟲株DNA為模板，應(yīng)用所建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

表1　單管套式PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design of single tube nested PCR

1.2.4敏感性試驗(yàn) 用分光光度計(jì)測(cè)定弓形蟲RH蟲株陽(yáng)性樣品DNA含量，連續(xù)10倍倍比稀釋，應(yīng)用所建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5單管套式PCR檢測(cè)方法的臨床應(yīng)用 應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法對(duì)來(lái)自關(guān)中地區(qū)某羊場(chǎng)的137份奶山羊血液樣品進(jìn)行弓形蟲檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用所建立的檢測(cè)方法在弓形蟲RH蟲株DNA樣品、待檢血液DNA陽(yáng)性樣品中均擴(kuò)增出216bp左右的片斷，陰性對(duì)照無(wú)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1　弓形蟲單管套式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Single tube nested PCR for detection of T.gondii PCR

2.2特異性試驗(yàn)結(jié)果

應(yīng)用建立的檢測(cè)方法在弓形蟲RH蟲株DNA（陽(yáng)性對(duì)照）中能擴(kuò)增出216bp的條帶且無(wú)雜帶，而在山羊泰勒蟲、微小隱孢子蟲、藍(lán)氏賈第蟲DNA和陰性對(duì)照中均不能擴(kuò)增出該片段（圖2）。

2.3敏感性試驗(yàn)結(jié)果

分光光度計(jì)測(cè)得弓形蟲RH蟲株DNA樣品濃度為102.1ng/μL，連續(xù)10倍倍比稀釋，對(duì)不同稀釋度進(jìn)行單管套式PCR檢測(cè)，結(jié)果最低可檢測(cè)到1fg的弓形蟲DNA（圖3）。

2.4臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用單管套式PCR檢測(cè)奶山羊血液DNA樣品137份，結(jié)果檢出38份為陽(yáng)性，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast鑒定均為弓形蟲。

圖2　單管套式PCR特異性試驗(yàn)Fig.2 The specificity test of single tube nested PCR

圖3　單管套式PCR敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of single tube nested PCR

3　討論

多數(shù)人類和動(dòng)物在感染弓形蟲之后缺乏臨床癥狀，很難通過(guò)臨床來(lái)確定是否為弓形蟲感染，加之DNA抽提時(shí)的降解以及純度不夠而導(dǎo)致PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性?；谝陨弦蛩?，考慮到單管套式PCR比常規(guī)PCR的優(yōu)越性［10-11］，本試驗(yàn)擬根據(jù)弓形蟲RH蟲株529bp重復(fù)序列，建立一種弓形蟲單管套式PCR檢測(cè)方法。通常PCR檢測(cè)弓形蟲所使用的靶基因有35拷貝的B1基因、110拷貝的ITS1和300拷貝的529bp重復(fù)序列，其中529bp重復(fù)序列有更高的敏感性，因此，更加適合用于臨床樣

品的檢測(cè)［12-16］。

本試驗(yàn)采用2次PCR的4個(gè)引物置于同一PCR管中進(jìn)行擴(kuò)增的方法。而常規(guī)的套式PCR采用了將第1次PCR的產(chǎn)物再取出加入到第2次PCR的反應(yīng)體系中，該法操作煩瑣、費(fèi)時(shí)且增加了污染的可能性。但一次性加入引物的單管套式PCR方法對(duì)內(nèi)外引物的Tm值有特殊要求，即外引物的退火溫度高，內(nèi)引物退火溫度低，二者相差至少5℃。其目的是反應(yīng)開(kāi)始的若干輪循環(huán)中外引物可以在較高的溫度結(jié)合到模板DNA上，而內(nèi)引物由于Tm值較低，無(wú)法結(jié)合到模板DNA上，從而只擴(kuò)增外引物的目的基因片斷。外引物耗盡后，再采用較低的退火溫度，主要是為了增加內(nèi)引物的擴(kuò)增效率。為避免外引物干擾后面的循環(huán)，可盡量減少外引物的量，從而確保外引物可以被耗盡。該方法具有高度的特異性和敏感性，能夠客觀地反映弓形蟲的感染情況，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值，為更好地進(jìn)行弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查提供了有效的技術(shù)手段。

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Establishment and Application of Single-tube Nested PCR for Detection of Toxoplasma gondii in Dairy Goats

KAN Song-he1，2，LIU Xia1，LIN Qing1
（1.College of Veterinary Medicine，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi，712100，China；2.National Key Lab Cultivating Base of Plateau Grazing Animal Nutrition and Ecology，Qinghai Academy of Animal Science and Veterinary Medicine，Qinghai University，Xining，Qinghai，810016，China）

Abstract：According to 529bp repetitive sequence of Toxoplasma gondii RH strain published in GenBank，2pairs of specific primers，including external and internal primers were designed，and a single tube nested PCR method for detection of Toxoplasma gondii was established，then specificity test，sensitivity test and test for clinical samples of dairy goats were conducted.The results suggested that this method can amplify 216bp gene fragment being homologous to the related sequences in GenBank.No cross-reactions were found in genome of Theileria hirci，Cryptosporidiumor Giardia lamblia，and the method can detect 1fg DNA as a minimum.38were positive in 137clinical samples of dairy goats by this method.In short，this method was highly specific，sensitive and valuable in clinical application for detection of Toxoplasma gondii in dairy goats.

Key words：529bp repetitive sequence；Toxoplasma gondii；single-tube nested PCR；Toxoplasmosis；dairy goat

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：闞松鶴（1989-），女，黑龍江拜泉人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物疫病防治研究。＊

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2013K01-60-02）；省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地基金資助。

收稿日期：2014-10-17

中圖分類號(hào)：S852.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0033-03