寧官保，劉國(guó)莉，張　鼎，李宏全，馬海利，高榮琨，郝衛(wèi)芳，高文偉，趙宇軍，高詩(shī)敏，李建慧，李桂蘭，閆　芳，田文霞＊（.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷0080；.介休市勞動(dòng)和社會(huì)保障局，山西介休0000；.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢0070；.太原市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原000）

?

雞毒支原體膠體金免疫層析試紙條的研制和初步應(yīng)用

寧官保1，劉國(guó)莉2，張鼎3，李宏全1，馬海利1，高榮琨1，郝衛(wèi)芳4，高文偉1，趙宇軍1，高詩(shī)敏1，李建慧1，李桂蘭1，閆芳1，田文霞1＊
（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.介休市勞動(dòng)和社會(huì)保障局，山西介休032000；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070；4.太原市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西太原030024）

摘 要：為研制一種用于快速檢測(cè)雞毒支原體（MG）的膠體金免疫層析試紙條，采用直徑20nm的膠體金顆粒標(biāo)記純化的MG多克隆抗體，硝酸纖維素膜檢測(cè)線和質(zhì)檢線分別噴加純化的MG多克隆抗體和兔抗雞IgG抗體，制作膠體金試紙條。試紙條檢測(cè)MG陽(yáng)性顯示兩條紅色反應(yīng)條帶；陰性為一條紅色反應(yīng)帶。本試紙條可檢測(cè)到1∶1 280倍稀釋的MG抗原，即顏色變化單位為8×104CCU/mL，具有高度的靈敏性。用試紙條檢測(cè)衣原體、滑液支原體、豬肺炎支原體、雞大腸埃希菌和雞白痢沙門菌等均呈陰性，表明該試紙條具有較好的特異性。對(duì)試紙條檢測(cè)呈MG陽(yáng)性的38只病雞進(jìn)行MG培養(yǎng)驗(yàn)證，所得結(jié)果一致；同時(shí)對(duì)MG培養(yǎng)檢測(cè)的另外95份病雞樣品進(jìn)行試紙條測(cè)試比對(duì)，符合率為96.84%，證明該試紙條具有很高的準(zhǔn)確性。該膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)MG操作簡(jiǎn)單，靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性等均符合要求，可以用于養(yǎng)殖場(chǎng)批量MG的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：雞毒支原體；膠體金；免疫層析；試紙條

雞毒支原體病是由雞毒支原體（Mycoplsma gallisepticum，MG）引起的傳染病，其臨床特征包括呼吸啰音、咳嗽、流鼻液等，主要病變是氣囊渾濁，鼻道、氣管及支氣管內(nèi)有干酪樣滲出物［1-2］。本病可以通過(guò)垂直和水平方式傳播，這也是造成雞毒支原體感染率高，分布面積廣，難以根除的重要原因［3］。本病在世界養(yǎng)禽國(guó)家均流行，且常繼發(fā)或并發(fā)新城疫、傳染性支氣管炎、大腸桿菌病等傳染病。在老疫區(qū)，本病常呈隱性感染，發(fā)病慢、病程長(zhǎng)，無(wú)法根除。目前對(duì)雞毒支原體病的血清學(xué)診斷方法主要包括血清平板凝集試驗(yàn)（SPA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Dot-ELISA）等。這些方法雖然能有效地診斷雞毒支原體病，但均在不同程度上存在成本高、專業(yè)性強(qiáng)、主觀依賴性、操作繁瑣等缺點(diǎn)，難以在生產(chǎn)一線實(shí)現(xiàn)大規(guī)模簡(jiǎn)易檢測(cè)。膠體金免疫層析（GICA）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫學(xué)檢測(cè)方法，能通過(guò)檢測(cè)血清抗原、抗體存在，準(zhǔn)確診斷各種疾病的發(fā)生［4-5］。目前市場(chǎng)上已有多種用于雞病診斷的膠體金免疫層析試紙產(chǎn)品，但尚沒(méi)有針對(duì)雞毒支原體病診斷的試紙。本研究旨在制備可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便檢測(cè)MG的膠體金免疫層析試紙條，為雞毒支原體病診斷提供工具。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株 雞毒支原體弱毒活疫苗購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司；雞毒支原體凍干菌株為天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院楊百亮教授惠贈(zèng)。

1.1.2主要試劑、材料 氯金酸、檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維濾紙購(gòu)自上海派坤生物制品有限公司；雞支原體平板凝集抗原購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；MG多克隆抗體、兔抗雞IgG抗體系山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2方法

1.2.1MG的分離及CCU的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［6］進(jìn)行MG的分離和鑒定，并對(duì)培養(yǎng)的MG進(jìn)行顏色變化單位（CCU）測(cè)定。具體為向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中分別加入肉湯培養(yǎng)基180μL，于前7排每排的第1孔分別加入MG液體培養(yǎng)物20μL，然后按10倍倍比稀釋至第12孔后棄去多余的20μL液體，第8排孔不加

MG液體培養(yǎng)物作空白對(duì)照。加蓋后用醫(yī)用橡皮膠帶封住周圍的縫隙以防止漏氣，37℃培養(yǎng)，每日觀察結(jié)果，當(dāng)變色孔不再增加后確定終點(diǎn)。以導(dǎo)致顏色改變的待測(cè)分離物的最高稀釋度作為1CCU/mL。

1.2.2雞MG多克隆抗體的制備、純化 點(diǎn)眼法對(duì)雞免疫雞毒支原體弱毒疫苗，分別于第7天和14天收集血清。標(biāo)準(zhǔn)MG陽(yáng)性血清做對(duì)照，平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)血清MG抗體效價(jià)。達(dá)到要求后，鹽析法對(duì)血清蛋白進(jìn)行粗提純，后采用飽和硫酸銨-DEAE-纖維素層析法進(jìn)一步純化MG多抗。紫外吸收法測(cè)定MG多克隆抗體濃度［7-8］。

1.2.3兔抗雞IgG抗體的制備、純化 心臟采集健康雞血液，分離、收集血清。鹽析法粗提雞IgG免疫球蛋白，離子交換層析法純化血清IgG。將純化好的雞IgG與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑乳化制成疫苗，對(duì)家兔進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射初次免疫。1個(gè)月后用弗氏不完全佐劑乳化苗再加強(qiáng)免疫1次，后收集血清，利用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)其效價(jià)。兔抗雞IgG抗體純化及其濃度測(cè)定同1.2.2。

1.2.4膠體金溶液的制備 采用檸檬酸鈉還原法制備直徑約為20nm的膠體金［9-10］，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5膠體金標(biāo)記MG抗體最低標(biāo)記量、最適pH值確定 將MG抗體按照100μg/mL～500μg/mL做逐級(jí)濃度稀釋后，各取0.1mL分別與1mL膠體金溶液混合，靜置5min后，再分別加入0.1mL 100g/L 的NaCl溶液，混勻靜置，觀察溶液顏色變化以確定MG抗體最低標(biāo)記量。用HCl或K2CO3調(diào)節(jié)儲(chǔ)存膠體金溶液pH為5.5～8.5，各取1mL后加入最適MG抗體濃度，混勻后加入0.1mL 100g/L的NaCl，再次混勻后靜置，觀察溶液顏色變化，以確定膠體金標(biāo)記所需最適pH［11］。

1.2.6MG抗體的膠體金標(biāo)記 在膠體金標(biāo)記MG抗體的最低標(biāo)記量的基礎(chǔ)上再加上20%為穩(wěn)定膠體金所需MG抗體的實(shí)際用量［12］。在電磁攪拌下，將抗體溶液加入膠體金溶液中，靜置15min后，加入終濃度為10mL/L的BSA，4℃過(guò)夜。采用低溫超速離心法純化膠體金標(biāo)記MG抗體，最后將沉淀溶于原體積1/10的TBS中。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7硝酸纖維素膜包被雞MG抗體、兔抗雞IgG抗體稀釋度的選擇 用0.05 mol/L的PBS溶液（pH7.0）將雞MG抗體從100μg/mL～500μg/mL做濃度梯度稀釋，包被于硝酸纖維素膜上，同時(shí)將MG做不同比例稀釋與包被的MG抗體結(jié)合，作方陣試驗(yàn)，確定檢測(cè)線的雞MG抗體的最適稀釋度。用確定的最適稀釋度的MG抗體噴于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線，把兔抗雞IgG抗體從100μg/mL～600μg/mL做濃度梯度稀釋，并與檢測(cè)線的MG抗體結(jié)合，做方陣試驗(yàn)，確定兔抗雞IgG的最適稀釋度。

1.2.8膠體金免疫層析試紙條的制備 試紙條組裝步驟參照文獻(xiàn)［13-14］。試紙條結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1　膠體金試紙條組裝示意圖Fig.1 Assembly diagram of the colloidal gold strip

1.2.9試紙條的使用方法和結(jié)果判斷 將膠體金免疫層析試紙條從4℃環(huán)境中取出，恢復(fù)到室溫。用標(biāo)準(zhǔn)MG做陽(yáng)性對(duì)照，PBS溶液做陰性對(duì)照。分別將試紙條樣品墊端浸入含有MG和PBS溶液檢樣的容器中，取出平放，靜置10min觀察結(jié)果。陰性結(jié)果試紙條檢測(cè)線不顯色，僅質(zhì)控線顯色，出現(xiàn)1條紅線；陽(yáng)性結(jié)果試紙條檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯色，出現(xiàn)2條紅線。

1.2.10試紙條性能檢測(cè) 用試紙條分別對(duì)蒸餾水、0.05mol/L PBS、TBS、衣原體、滑液支原體、豬肺炎支原體、雞大腸埃希菌和雞白痢沙門菌進(jìn)行檢測(cè)，以測(cè)試試紙條的特異性。用生理鹽水稀釋MG，從10倍開(kāi)始做倍比稀釋至2 560倍，用試紙條分別進(jìn)行檢測(cè)，觀察檢測(cè)線和質(zhì)控線有無(wú)及清晰程度，以測(cè)試試紙條敏感性。隨機(jī)抽取不同批次和批間的試紙條進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，以測(cè)試試紙條重復(fù)性。

1.2.11MG膠體金試紙條的初步應(yīng)用 分別對(duì)太谷某雞場(chǎng)的38只疑似MG病雞、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集的95份病雞樣品用研制的試紙條進(jìn)行MG檢測(cè)。并對(duì)所有樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原培養(yǎng)、平板凝集試驗(yàn)驗(yàn)證檢測(cè)，結(jié)果與MG膠體金試紙檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，比較結(jié)果符合率。

2　結(jié)果

2.1分離MG的CCU測(cè)定

CCU測(cè)定結(jié)果顯示，將MG液體培養(yǎng)物在細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行10倍系列稀釋，37℃培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)6d后變色孔停止增加，終點(diǎn)稀釋度均為10-8。即MG顏色變化單位為1×108CCU/mL。

2.2雞MG抗體及兔抗雞IgG抗體效價(jià)、濃度測(cè)定

采用平板凝集試驗(yàn)測(cè)定雞MG抗體效價(jià)，雙向

瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定兔抗雞IgG抗體效價(jià)，紫外吸收法測(cè)定MG抗體、兔抗雞IgG抗體濃度。結(jié)果顯示：雞MG抗體的平均效價(jià)為1∶200，濃度為3.87 mg/mL。兔抗雞IgG抗體的平均效價(jià)為1∶64，濃度為5.26mg/mL。

2.3膠體金標(biāo)記MG抗體最低標(biāo)記量和最適pH測(cè)定

對(duì)MG抗體做100μg/mL～500μg/mL的逐級(jí)濃度稀釋，觀察與1mL膠體金結(jié)合后的顏色變化，確定用于膠體金標(biāo)記的MG抗體的最低標(biāo)記量為35μg/mL。通過(guò)調(diào)節(jié)膠體金溶液pH范圍，確定膠體金標(biāo)記MG抗體的最適pH為7.5。

2.4硝酸纖維素膜包被雞MG抗體、兔抗雞IgG抗體最適稀釋度測(cè)定

對(duì)雞MG抗體、兔抗雞IgG抗體濃度梯度稀釋，做方陣試驗(yàn)，確定用于硝酸纖維素膜包被的雞MG抗體、兔抗雞IgG抗體最適稀釋度分別為400 μg/mL和500μg/mL。

2.5試紙條性能檢測(cè)

用試紙條分別對(duì)蒸餾水、0.05mol/L的PBS、TBS、衣原體、滑液支原體、豬肺炎支原體、雞大腸埃希菌和雞白痢沙門菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，試紙條對(duì)上述樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明該試紙條具有較好的特異性。用試紙條檢測(cè)倍比稀釋MG結(jié)果顯示，本試紙條可檢測(cè)到1∶1 280倍稀釋的MG，即CCU單位為8×104CCU/mL，具有很高的靈敏度。對(duì)不同批次和批間的試紙條進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，該試紙條穩(wěn)定性良好，無(wú)變異現(xiàn)象。

2.6MG膠體金試紙條的初步應(yīng)用

用制備的膠體金免疫層析試紙條對(duì)山西省太谷縣某養(yǎng)雞場(chǎng)的38只病雞進(jìn)行測(cè)試，均呈現(xiàn)陽(yáng)性，與平板凝集試驗(yàn)、MG培養(yǎng)結(jié)果一致。對(duì)收集的95份病雞樣品進(jìn)行FM-4培養(yǎng)基培養(yǎng)，確診了35份陽(yáng)性樣品。然后用平板凝集試驗(yàn)和自制的MG免疫層析試紙條對(duì)其進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)試驗(yàn)。在已經(jīng)確診的35份樣品中，試紙條檢測(cè)出32份陽(yáng)性樣品，平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)出33份陽(yáng)性樣品。對(duì)已經(jīng)確診的60份陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，平板凝集試驗(yàn)和試紙條法均未檢測(cè)出陽(yáng)性樣品。試紙條和培養(yǎng)法檢測(cè)樣品的陽(yáng)性符合率為91.43%（32/35），總符合率為96.84%（92/ 95）。平板凝集試驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法的陽(yáng)性符合率94.29%（33/35），總符合率為97.89%（93/95）。試紙條和平板凝集試驗(yàn)兩種方法比較，陽(yáng)性符合率為96.97%（32/33），總符合率為98.92%（92/93）。兩種試驗(yàn)方法的結(jié)果比較一致。證明研制的MG試紙條具有很高的準(zhǔn)確性。

3　討論

MG是一種很小的原核生物，對(duì)體外培養(yǎng)條件要求很高，無(wú)法在一般培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。近年出現(xiàn)的其他MG檢測(cè)手段操作繁瑣、主觀性強(qiáng)。本文首次建立MG膠體金免疫層析試紙條診斷雞MG感染，其檢測(cè)樣品用量少（＜1 mL），操作簡(jiǎn)便，可在10 min內(nèi)觀察結(jié)果，具有較高的臨床實(shí)用性。準(zhǔn)確性、靈敏性和特異性是影響膠體金試紙檢測(cè)效果的三大關(guān)鍵指標(biāo)，該試驗(yàn)在開(kāi)展過(guò)程中反復(fù)論證，從多個(gè)環(huán)節(jié)確保膠體金試紙條檢測(cè)的有效性。

靈敏性方面，膠體金顆粒的大小是影響試紙靈敏度的重要因素之一。膠體金顆粒的大小對(duì)其與抗體的偶聯(lián)以及偶聯(lián)后的靈敏度影響很大。膠體金顆粒過(guò)大會(huì)使選擇的硝酸纖維素膜的孔徑增加，抗體偶聯(lián)后擴(kuò)散能力下降，降低檢測(cè)的靈敏度；膠體金顆粒過(guò)小會(huì)增加標(biāo)記時(shí)加入的蛋白質(zhì)量［15］。本試驗(yàn)選擇直徑20nm的膠體金顆粒，大小適宜。同時(shí)通過(guò)濃度梯度稀釋，對(duì)膠體金標(biāo)記所需的MG抗體最低標(biāo)記量、最適pH進(jìn)行測(cè)定，保證了膠體金與MG抗體的結(jié)合比例和效率，從而最大程度地提高了試紙條的靈敏性。

準(zhǔn)確性方面，在硝酸纖維素膜上分別位于檢測(cè)線和質(zhì)控線的雞MG抗體和兔抗雞IgG抗體的包被濃度是影響試紙準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素［16］?？贵w包被濃度過(guò)高會(huì)造成假陽(yáng)性，濃度過(guò)低又會(huì)降低試紙靈敏度和準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)通過(guò)抗體濃度梯度稀釋，建立方陣試驗(yàn)，確定雞MG抗體和兔抗雞IgG抗體的最適稀釋度，保證了兩者在檢測(cè)過(guò)程中與膠體金標(biāo)記蛋白復(fù)合物的結(jié)合。試驗(yàn)將試紙條所檢測(cè)出的陽(yáng)性結(jié)果與其他方法進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法和平板凝集試驗(yàn)法的檢測(cè)結(jié)果符合率分別達(dá)到94.29%和96.97%，這顯示試紙條具有很高的準(zhǔn)確性，能顯著避免檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

特異性方面，該試紙條不與衣原體、滑液支原體、豬肺炎支原體、雞大腸埃希菌和雞白痢沙門菌等病原體作用，證明其具有很好的特異性。試驗(yàn)后期，用檢驗(yàn)合格的MG膠體金試紙條對(duì)山西省太谷縣某雞場(chǎng)以及本實(shí)驗(yàn)室收集的病雞樣本進(jìn)行了初步檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證了制作的MG膠體金層析試紙條，且試驗(yàn)數(shù)據(jù)在一定程度上反映了太谷縣周邊地區(qū)雞MG感染狀況，為下一步雞MG感染的防控提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 郭偉娜.雞毒支原體感染的流行和控制［J］.山東畜牧獸醫(yī)，

2010，31（5）：80-81.

［2］ 劉軼秋，張 媛，薛青紅，等.恩諾沙星與其他抗菌藥對(duì)雞毒支原體的體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47（12）：46-50.

［3］ Xiao X，Zhao D H，Yang X，et al.Mycoplasma gallisepticum and E.coli mixed infection model in broiler chickens for studying valnemulin pharmacokinetics［J］.J Vet Pharmacol Therap，2014，37（1）：99-102.

［4］ Zhu A，Huo R，Zhou W，et al.Establishment of colloidal gold immunochromatography strip for detection of florfenicol residues［J］.Cur Pharma Anal，2014，10（4）：263-270.

［5］ 莊金秋，梅建國(guó)，沈志強(qiáng).膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29（9）：70-75.

［6］ 齊新永，徐 鋒，張維誼，等.上海地區(qū)雞毒支原體的分離與鑒定［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2013（6）：24-25.

［7］ 高莉萍，盛鳳仙，浦奕奕，等.紫外分光光度法快速測(cè)定人纖維蛋白原制品中蛋白質(zhì)含量［J］.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，24（1）：41-42.

［8］ 彭伏虎.禽流感與新城疫膠體金免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)及初步應(yīng)用研究［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［9］ 李淑群，曹碧云，?；拢?膠體金免疫層析法快速檢測(cè)牛奶、奶粉、飼料中的三聚氰胺［J］.分析化學(xué)，2013，41（7）：1025-1030.

［10］ Zhang J，Guo Y，Hu S，et al.An adhesion molecule-based colloidal gold immunochromatography assay strip for rapidly and specifically detecting chicken antibodies against Mycoplasma gallisepticum［J］.Res Vet Sci，2011，90（3）：379-384.

［11］ Niu K，Zheng X，Huang C，et al.A Colloidal gold nanoparticle-based immunochromatographic test strip for rapid and convenient detection of Staphylococcus aureus［J］.J Nanosci Nanotechnol，2014，14（7）：5151-5156.

［12］ Hampl J，Hall M，Mufti N A，et al.Upconverting phosphor reporters in immunochromatographic assays［J］.Anal Biochem，2001，288（2）：176-187.

［13］ 張紹庚，段躍強(qiáng)，張德璽，等.膠體金免疫層析試紙條快速檢測(cè)乙型流感病毒［J］.免疫學(xué)雜志，2012，28（11）：981-984.

［14］ 孫 婧.犬瘟熱病毒單克隆抗體夾心ELISA檢測(cè)方法和膠體金免疫層析試紙條的研究［D］.山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［15］ 姜金慶，楊雪峰，王自良，等.克倫特羅和萊克多巴胺多殘留膠體金免疫層析試紙條的研制［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（1）：87-94.

［16］ 王宵雪.恩諾沙星免疫膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制［D］.天津：天津科技大學(xué)，2012.

Development and Application of Colloidal Gold Immunochromatographic Strip for Rapid Detection of Mycoplsma gallisepticum

NING Guan-bao1，LIU Guo-li2，ZHANG Ding3，LI Hong-quan1，MA Hai-li1，GAO Rong-kun1，HAO Wei-fang4，GAO Wen-wei1，ZHAO Yu-jun1，GAO Shi-min1，LI Jian-hui1，LI Gui-lan1，YAN Fang1，TIAN Wen-xia1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi，030801，China；2.Jiexiu Municipal Labor and Social Security Bureau，Jiexiu，Shanxi，032000，China；3.College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei，430070，China；4.Taiyuan Center for Disease Control and Prevention，Taiyuan，Shanxi，030024，China）

Abstract：This study aimed to develop a colloidal gold immunochromatographic strip specific for Mycoplsma gallisepticum（MG）detection.a 20nm-diameter colloidal gold was selected to mark the purified MG anbibody，which was then wrapped with nitrocellulose membrane.Another purified MG antibody and rabbitanti-chicken IgG antibody was also connected to nitrocellulose membrane as test line and control line respectively.Two red reaction stripes both on the test and control line showed up when the finished strip was justified with the standard MG antigen；while only one red line appeared on the control line in the negative samples.The strips can detect the diluted MG antigens up to 1∶1 280（8×104CCU/mL），indicating a satisfied sensitivity.We also justified the qualified specificity of the strip by testing Chlamydia，Mycoplsma synoviae，Mycoplasma hyopneumoniae，chicken Escherichia coli and Salmonella，all of which presented negative results.To evaluate the accuracy of the strip，we verified the 70positive samples and 60 negative samples tested with strips using laboratory MG cultivation and plat agglutination methods.Results showed that the strip had a total coincidence of 98.92% with laboratory MG cultivation way，and 96.97% with the plat agglutination method.In conclusion，the developed colloidal gold immunochromatographic strip had qualified requirements of specificity，sensitivity and accuracy，and was recommended to extensively apply in the clinic MG disease diagnosis.

Key words：Mycoplasma gallisepticum；colloidal gold；immunochromatography；strip

通訊作者

作者簡(jiǎn)介：寧官保（1961-），男，山西聞喜人，副教授，主要從事生物技術(shù)研究。＊

基金項(xiàng)目：山西省自然科學(xué) （2014011028-1，2009011043-1）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311027-3）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31072179）

收稿日期：2014-12-06

中圖分類號(hào)：S852.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）05-0025-04