史夢婷，孟露萍，包海洋，付　強(qiáng)，史慧君，王慧勤，張　輝，任　艷，喬　軍，陳創(chuàng)夫＊（.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子8000；.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子8000；.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子8000）

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結(jié)核分支桿菌Rv2031c慢病毒載體的構(gòu)建及其對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響

史夢婷1△，孟露萍2△，包海洋2△，付強(qiáng)2，史慧君2，王慧勤1，張輝2，任艷3，喬軍2，陳創(chuàng)夫2＊
（1.石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子832000；2.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子832000；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000）

摘 要：研究結(jié)核分支桿菌Rv2031c基因?qū)π∈缶奘杉?xì)胞RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中結(jié)核分支桿菌Rv2031c的序列設(shè)計(jì)引物，以結(jié)核分支桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株滅活的菌液上清液為模版，擴(kuò)增Rv2031c基因；克隆至慢病毒表達(dá)載體plex-EGFP中，經(jīng)酶切和測序鑒定后，獲得plex-Rv2031c-EGFP重組慢病毒載體；將重組慢病毒質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后收集慢病毒，并侵染RAW264.7細(xì)胞；侵染48h時(shí)收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各試驗(yàn)組巨噬細(xì)胞的凋亡率；提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR檢測Rv2031c基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況；同時(shí)，使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測Rv2031c蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了Rv2031c的慢病毒表達(dá)載體plex-Rv2031c-EGFP；構(gòu)建了過表達(dá)Rv2031c的慢病毒Rv2031c-lv；感染Rv2031c-lv的RAW264.7細(xì)胞的凋亡率為41.8%，而對照組EGFP-lv感染的RAW264.7細(xì)胞其凋亡率為30.0%；PCR結(jié)果表明Rv2031c在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7細(xì)胞中高表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示Rv2031c蛋白在Rv2031c-lv侵染的RAW264.7細(xì)胞中高表達(dá)。該研究成功構(gòu)建了結(jié)核分支桿菌Rv2031c的慢病毒表達(dá)載體并驗(yàn)證了其對RAW264.7細(xì)胞凋亡的影響，為結(jié)核分支桿菌在機(jī)體內(nèi)潛伏期感染的藥物研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：Rv2031c；慢病毒；RAW264.7細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

結(jié)核病（Mycobacterium，TB）是由結(jié)核分支桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種人獸共患慢性傳染病，是繼艾滋病之后的最大感染性疾病之一［1］。結(jié)核病對家畜以及人的危害都很嚴(yán)重［2］。在我國呈現(xiàn)感染基數(shù)大，傳染源多，而發(fā)現(xiàn)率低至26%等特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人和動物的健康［3］。作為人獸共患和慢性消耗性傳染病的結(jié)核病擁有廣泛的宿主，且可以交互傳染，很難徹底消滅［4］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，全世界感染結(jié)核分支桿菌的人數(shù)大約占到了30%，而真正發(fā)病的人數(shù)僅僅為其中的1/9，其他都處于結(jié)核病的休眠期。且處于休眠期的結(jié)核分支桿菌對現(xiàn)已廣泛使用的結(jié)核疫苗不敏感。這種傳染性極強(qiáng)的疾病之所以發(fā)現(xiàn)率低，是由于結(jié)核分支桿菌在進(jìn)入寄主后會在肺泡巨噬細(xì)胞中繁殖，而寄主的局部免疫等反應(yīng)會抑制這一過程的發(fā)生，從而使結(jié)核分支桿菌進(jìn)入潛伏感染期，在這一階段中患者無任何病癥［5］；處于潛伏感染期即休眠期的結(jié)核分支桿菌生存活力低，導(dǎo)致抗結(jié)核藥物對其效果差。因此，處于潛伏期的結(jié)核病患者成為了結(jié)核病傳播的重要隱患［6］。潛伏期的存在也使結(jié)核病的復(fù)發(fā)困擾著已經(jīng)治愈的患者。研究發(fā)現(xiàn)，處于潛伏期的結(jié)核分支桿菌能編碼與休眠有關(guān)的蛋白48個(gè)［5］，而其中表達(dá)量較高的以及免疫原性較突出的一種蛋白就是Rv2031c。Rv2031c具有較高的免疫原性，而且在結(jié)核分支桿菌的潛伏期表達(dá)量較高［7］。因此，本研究中以Rv2031c蛋白為研究對象，研究慢病毒介

導(dǎo)Rv2031c基因過表達(dá)后對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的影響，為探究結(jié)核分支桿菌的潛伏期提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1載體 慢病毒表達(dá)載體plex-EGFP及其包裝質(zhì)粒（pSPAX和pMD2.G）均由劉明軍教授（新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心）惠贈。

1.1.2主要試劑 Annexin V-APC/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；鼠抗Rv2031c抗體（貨號ab64786）購自美國Abcam公司；鼠抗β-actin抗體（貨號BS6007M）和山羊抗鼠IgG（H+L）-HRP二抗（貨號BS50350）均購自南京Bioworld公司；高純度質(zhì)粒大提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；增強(qiáng)型HRP-DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液和PMSF購自江蘇碧云天生物科技公司；pMD19-T載體和限制性內(nèi)切酶（SpeⅠ和XhoⅠ）購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)胞RNA提取試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒、無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；聚凝胺購自美國Sigma公司；HET磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自深圳百恩維生物科技有限公司；其他分子生物學(xué)試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3細(xì)胞和菌株 小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）以及人胚腎細(xì)胞（293T）購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；所有細(xì)胞都使用含100mL/L胎牛血清（Gibco）的DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco）進(jìn)行培養(yǎng)；結(jié)核分支桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv為石河子大學(xué)動物疫病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中結(jié)核分支桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的Rv2031c基因序列（登錄號AL123456），使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Rv2031c序列（表1），引物由北京六合華大基因有限公司合成。帶下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

表1　擴(kuò)增Rv2031c基因的引物Table 1 Primers for amplifying Rv2031cgene

1.2.2Rv2031c基因的克隆 以結(jié)核分支桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv cDNA為模版，用Rv2031c-F和 Rv2031c-R引物擴(kuò)增含酶切位點(diǎn)Rv2031c序列。PCR反應(yīng)體系為：Taq PCR Master mix 10.0μL，上、下游引物各0.6μL，模板1.0μL，補(bǔ)ddH2O至20.0μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃40s，67℃40s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。用15g/L瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物；并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的基因，并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌液PCR、酶切以及測序鑒定后，獲得重組載體Rv2031c-pMD19-T。

1.2.3慢病毒表達(dá)載體plex-Rv2031c-EGFP的構(gòu)建使用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶酶切plex-EGFP和Rv2031cpMD19-T，酶切體系為：10×H buffer 2.0μL，SpeⅠ和XhoⅠ各1.0μL，plex-EGFP/Rv2031c-pMD19-T 10.0 μL，補(bǔ)ddH2O至20.0μL；置于37℃孵育4h。使用凝膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，并將雙酶切目標(biāo)產(chǎn)物使用T4DNA連接酶連接；連接體系為：plex-EGFP 1.5μL，Rv2031c回收產(chǎn)物4.5μL，T4DNA連接酶1.0μL，補(bǔ)ddH2O至10.0μL；置于16℃過夜連接；并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)PCR、酶切以及測序鑒定后，獲得重組載體plex-Rv2031c-EGFP。

1.2.4慢病毒包裝 使用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒并按照其說明書提取plex-Rv2031c-EGFP、plex-EGFP、pSPAX和pMD2.G質(zhì)粒；接種1×106個(gè)293T細(xì)胞至10cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80%匯合度；按照HET磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將12.0μg plex-Rv2031c-EGFP/ plex-EGFP及慢病毒包裝質(zhì)粒（9μg pSPAX和4μg pMD2.G）共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中；轉(zhuǎn)染后12h時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后48h時(shí)，收集上清并使用0.45 μm Millipore濾器過濾收集慢病毒。

1.2.5慢病毒侵染RAW264.7細(xì)胞 使用2.5g/L胰酶消化RAW264.7細(xì)胞，并按5×105個(gè)/孔的濃度將RAW264.7細(xì)胞接種到六孔板中，加入慢病毒懸液，并添加8.0μg/mL聚凝胺作為促感染劑；混勻后置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h后，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測凋亡水平 用2.5g/L胰酶消化慢病毒侵染后48h時(shí)的RAW264.7細(xì)胞，2 000 r/min離心5min收集細(xì)胞；用0.1mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次；加入500μL Binding buffer重懸細(xì)胞；加入5μL Annexin V-APC混勻后；再加入5μL 7-AAD染液，混勻；室溫避光反應(yīng)15min；用流式細(xì)胞儀FL4通道檢測Annexin V-APC的紅色熒光，并用FL3通道檢測7-AAD的紅色熒光。

1.2.7PCR檢測Rv2031c基因 收集慢病毒

Rv2031c-lv和EGFP-lv分別侵染后48 h時(shí)的RAW264.7細(xì)胞，使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R引物擴(kuò)增Rv2031c基因，PCR體系及條件同1.2.2。

1.2.8Western blot檢測Rv2031c表達(dá)水平 收集慢病毒侵染后48h時(shí)的RAW264.7細(xì)胞；按照RIPA裂解細(xì)胞試劑盒說明書，用RIPA裂解液（含1mmol/L PMSF）裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；并用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白的濃度；加入等質(zhì)量的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；Western blot方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》；鼠抗Rv2031c一抗稀釋度為1∶2 500，鼠抗β-actin一抗稀釋度為1∶5 000，山羊抗鼠IgG（H+L）-HRP二抗稀釋度為1∶10 000；使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行免疫印跡顯色。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析（ANOVA）。數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±SD）。＊P＜0.05為差異顯著；＊＊P＜0.01為差異極顯著。

2　結(jié)果

2.1Rv2031c基因克隆

以結(jié)核分支桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv cDNA為模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R作為上、下游引物，PCR擴(kuò)增Rv2031c基因，用15g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物（圖1），Rv2031c基因的PCR產(chǎn)物大小約為435bp，和預(yù)期的條帶大小相符。

圖1　Rv2031c的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of Rv2031c

2.2雙酶切鑒定重組慢病毒表達(dá)載體plex-Rv2031c-EGFP

使用SpeⅠ和XhoⅠ雙酶酶切重組慢病毒表達(dá)載體plex-Rv2031c-EGFP，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶酶切產(chǎn)物（圖2），出現(xiàn)plex-EGFP質(zhì)粒條帶（11 400 bp）和Rv2031c基因條帶（435bp），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.3慢病毒包裝

分別將慢病毒載體plex-Rv2031c-EGFP和plex-EGFP與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48h時(shí)，使用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。綠色熒光蛋白高表達(dá)，表明Rv2031c-lv和EGFP-lv成功包裝（圖3）。

圖2　Plex-Rv2031c-EGFP酶切結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion results of plex-Rv2031c-EGFP

圖3　慢病毒包裝Fig.3 Lentivirus generation

2.4慢病毒侵染RAW264.7細(xì)胞

Rv2031c-lv和EGFP-lv慢病毒分別感染RAW264.7細(xì)胞48h后，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)效果。慢病毒EGFP-lv和Rv2031c-lv感染RAW264.7細(xì)胞后，綠色熒光蛋白高效表達(dá)，表明慢病毒EGFP-lv和Rv2031c-lv能感染RAW264.7細(xì)胞，并且侵染效果較好（圖4）。

2.5PCR檢測Rv2031c基因

分別取EGFP-lv和Rv2031c-lv侵染的RAW 264.7細(xì)胞的cDNA作為模板，使用Rv2031c-F和Rv2031c-R引物進(jìn)行PCR。Rv2031c-lv侵染后，PCR可以檢測到Rv2031c基因，而EGFP-lv侵染不能檢測到該基因，其結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖5）。

2.6Western blot檢測Rv2031c蛋白表達(dá)水平

慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞后48h時(shí)，提取細(xì)胞總蛋白；Western blot技術(shù)檢測相同質(zhì)量總蛋白中Rv2031c蛋白含量。Rv2031c-lv感染的RAW264.7細(xì)胞后Rv2031c蛋白表達(dá)量較高；而EGFP-lv感染RAW264.7細(xì)胞后，未見Rv2031c蛋白表達(dá)，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖6）。

圖4　慢病毒侵染RAW264.7細(xì)胞Fig.4 RAW264.7infected with lentivirus

圖5　PCR檢測Rv2031c基因Fig.5 Detection of Rv2031cgene by PCR

圖6　Western blot檢測Rv2031c蛋白表達(dá)Fig.6 Detection of Rv2031cprotein expression by Western bloting

2.7細(xì)胞凋亡率的檢測

慢病毒感染RAW264.7細(xì)胞后48h時(shí)，收集細(xì)胞，使用凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色處理，并使用流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞凋亡水平。Rv2031c-lv感染RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率為41.8%；而EGFP-lv感染的RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率為30.0%。結(jié)果表明，Rv2031c-lv感染增加了RAW 264.7的凋亡率，同時(shí)也證明了Rv2031c基因表達(dá)促進(jìn)RAW264.7的凋亡（圖7和圖8）。

3　討論

Rv2031c在結(jié)核病的休眠期呈現(xiàn)了高表達(dá)的狀況，體現(xiàn)出了Rv2031c在結(jié)核病的休眠期有關(guān)鍵的作用［8］。為了降低結(jié)核病傳染源的數(shù)量，揭開結(jié)核病潛伏期的致病機(jī)制，所以本試驗(yàn)以潛伏期高表達(dá)高免疫原性的Rv2031c蛋白為研究對象，構(gòu)建重組慢病毒表達(dá)載體，并包裝慢病毒，侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7，從而利用慢病毒介導(dǎo)的方式使Rv2031c基因在RAW264.7細(xì)胞中高水平表達(dá)，從而為研究Rv2031c蛋白在結(jié)核分支桿菌潛伏期中的重要作用提供材料。雖然Rv2031c蛋白在潛伏期高表達(dá)，但其在結(jié)核分支桿菌感染過程中的具體作用尚未可知［9］。

圖7　流式細(xì)胞儀檢測RAW264.7細(xì)胞的凋亡率Fig.7 Detection of RAW264.7cell apoptosis rates by flow cytometry

圖8　RAW264.7細(xì)胞凋亡率的數(shù)據(jù)分析Fig.8 Data analysis of RAW264.7cell apoptosis rates

研究表明，Rv2031c實(shí)際上是結(jié)核分支桿菌hspX基因的重要組成部分，而Hsp16.3就是由hspX基因編碼的一類與結(jié)核病休眠期密切相關(guān)的重要的膜抗原［10］。Hsp16.3擁有鼠和人的T細(xì)胞抗原表位，能產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)，而且其肽段具有活化部分CD4T細(xì)胞和識別并活化CD8T細(xì)胞，分泌γ干擾素以及α干擾素的功能，之后被MTB感染的巨噬細(xì)胞被粒細(xì)胞溶解素和表位穿孔素溶解，最終有效殺滅結(jié)核分支桿菌［11］。本試驗(yàn)涉及的Rv2031c與Hsp16.3有直接關(guān)系，且由Rv2031c構(gòu)成的hspX基因能編碼Hsp 16.3［12］，而Hsp16.3能通過一系列干擾素的產(chǎn)生強(qiáng)有力地清除處于休眠期體內(nèi)的結(jié)核分支桿菌［13-14］，從而能有效的減少感染結(jié)核病并處于休眠期的患者數(shù)量，并為結(jié)核病休眠期的鑒定及治療奠定基礎(chǔ)。

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Constraction of Lentiviral Vector of Mycobacterium tuberculosis Rv2031c and Its Effects on Apoptosis of RAW264.7 Cells

SHI Meng-ting1，MENG Lu-ping2，BAO Hai-yang2，F(xiàn)U Qiang2，SHI Hui-jun2，WANG Hui-qin1，ZHANG Hui2，REN Yan3，QIAO Jun2，CHEN Chuang-fu2
（1.College of Life Science，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China；2.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China；3.College of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang，832000，China）

Abstract：To investigate the effects of Mycobacterium tuberculosis Rv2031cgene on apoptosis of RAW264.7macrophages，primers for Rv2031cwere designed based on GenBank database.Rv2031cgene was amplified fromMycobacterium tuberculosis international reference strain H37Rv and cloned into lentivirus expressing vectoe plex-EGFP. After identifying with enzyme digestion and sequencing，the recombinated lentivirus expressing vector plex-Rv2031c-EGFP was constructed successfully.After transfection lentivirus expressing vector with the helper plasmids into 293Tcells，lentiviral particles were generated.The rate of apoptosis was determined in RAW264.7cells using flow cytometry at 48hpost-infection with lentivirus.Total RNA was extracted from lentivirus infected RAW 264.7and reversely transcribed into cDNA，mRNA levels of Rv2031cwere detected using PCR.Moreover，cells were harvested and subjected to extract total protein，protein levels of Rv2031cwere determined by Western blot.Lentivirus expressing vector plex-Rv2031c-EGFP and Rv2031c-overexpressing lentivirus Rv2031c-lv were constructed successfully.Rate of apoptosis in Rv2031c-lv infected cells was 41.8%，whereas it was 30.0%in negative control group，suggesting Rv2031coverexpression significantly increased RAW264.7cells apoptosis.The results of PCR and Western blot indicated that Rv2031cwas high expressed in Rv2031c-lv infected cells compared to the negative control.In this study，we successfully constructed Rv2031cexpressing lentivirus and analyzed its function on RAW264.7apoptosis，which will provide a stable foundation on selecting drugs against Mycobacterium tuberculosisincubation period.

Key words：Rv2031c；lentiviruses；RAW264.7cell；apoptosis

作者簡介：史夢婷（1989-），女，新疆石河子人，碩士研究生，主要從事動物功能基因組與分子免疫學(xué)研究。孟露萍（1989-），女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事分子病毒學(xué)研究工作；包海洋（1989-），男（滿族），河北承德人，碩士研究生，主要從事結(jié)核分支桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：國際科技合作項(xiàng)目（2013DFR30970）；國家自然科學(xué) （U1303283）

收稿日期：2014-10-17

中圖分類號：S852.618

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）05-0001-05