陳雅慧，劉 冬，彭禮飛

(廣東醫(yī)學(xué)院1.寄生蟲學(xué)與臨床寄生蟲檢驗(yàn)學(xué)教研室、2.藥理學(xué)教研室，廣東 湛江 524023;3.廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 523808)

血栓栓塞性疾病不僅發(fā)病率高，而且致死率和致殘率也很高，如由血栓栓塞引起的心肌梗死、腦梗死、肺梗死居各種死亡原因之首。對(duì)血栓性疾病的防治藥物主要包括抗凝血、抗血小板和溶栓藥物。出血是目前臨床抗栓藥物防治最主要、最常見的并發(fā)癥。傳統(tǒng)的抗凝藥物，如華法林、肝素、低分子量肝素(LMWH)，以及近年上市的新藥，如FXa抑制劑(利伐沙班、阿哌沙班等)和凝血酶抑制劑(達(dá)比加群酯、水蛭素等)，對(duì)減少血栓形成均具有較好效果，但都還面臨著共同的不足——可能引起出血并發(fā)癥。因此，研發(fā)具有出血副作用小的抗栓新藥具有重要價(jià)值。近年來(lái)，有關(guān)人類FXI缺陷或FXI水平升高的臨床資料，以及動(dòng)物FXI缺陷或被抑制的抗栓實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)XI是出血風(fēng)險(xiǎn)小的抗栓防治新靶點(diǎn)。本文綜述了相關(guān)研究進(jìn)展，期望為出血風(fēng)險(xiǎn)小的抗栓新藥研發(fā)提供參考。

1 FXI在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)及血栓形成中的作用

凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)是系列凝血因子相繼被激活，最終形成纖維蛋白的過(guò)程，見Fig 1。凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)由內(nèi)源性途徑(又稱接觸激活途徑)及外源性途徑(又稱組織因子途徑)啟動(dòng)生成FXa，再經(jīng)共同途徑生成凝血酶(FIIa)，最終形成纖維蛋白。FXI是維持內(nèi)源性途徑所必需的，而且在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，凝血酶可反饋激活FXI，活化的FXI又促使凝血酶的大量產(chǎn)生，從而使凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大。因此，針對(duì)FXI靶點(diǎn)的藥物可阻斷內(nèi)源性途徑并抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的放大，從而具有抗血栓形成作用。同時(shí)，依賴FXIa生成的大量凝血酶可激活凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)而下調(diào)纖溶系統(tǒng)。

Fig 1 Coagulation cascade

2 人類FXI水平與血栓性疾病

2.1 人類FXI缺陷癥與出血人類FXI缺陷癥(FXI活性＜15U/dL)又稱 C型血友病，該類病人出血表型溫和［2］。FVIII缺陷及FIX缺陷病人(即甲型及乙型血友病)易引起自發(fā)性出血，常有關(guān)節(jié)和肌肉內(nèi)出血，也可見血尿、皮膚瘀傷及手術(shù)后出血。FX、FV缺陷病人也有嚴(yán)重的出血表現(xiàn)，而凝血酶原、FVII是人體生理所必需的，如過(guò)量減少將會(huì)引起大量出血，嚴(yán)重者致死［3］。但FXI缺陷病人很少出現(xiàn)自發(fā)性出血，罕見有關(guān)節(jié)出血和肌肉內(nèi)出血，出血傾向可發(fā)生于創(chuàng)傷或外科手術(shù)，尤其是在口腔、鼻和泌尿系統(tǒng)等高纖溶活性部位的創(chuàng)傷或外科手術(shù)，而其他外科創(chuàng)傷如整形外科、闌尾切除、包皮環(huán)割或皮膚切口等手術(shù)極少出現(xiàn)過(guò)量出血［2］。20%的嚴(yán)重FXI缺陷婦女生理期月經(jīng)量過(guò)多，但嚴(yán)重FXI缺乏并不影響懷孕與分娩［2］。從FXI缺陷病人出血表型溫和的特點(diǎn)來(lái)看，F(xiàn)XI被抑制時(shí)出血風(fēng)險(xiǎn)較小。

2.2 人類FXI缺陷癥與血栓性疾病在FXI缺陷病人中，缺血性腦卒中及深靜脈血栓(DVT)的發(fā)病率明顯降低［4-5］，表明FXI被抑制是有利于減少缺血性腦卒中及深靜脈血栓發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的。但有關(guān)FXI缺陷人群的研究數(shù)據(jù)還不能支持FXI缺陷對(duì)心肌梗死具有保護(hù)作用，需要進(jìn)一步研究。

2.3 人類高水平FXI與血栓性疾病在有患者及對(duì)照各474人關(guān)于血栓形成傾向的研究中，高FXI水平人群(10%)的DVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是其他90%人群的2.2倍，表明高水平的FXI是DVT發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且FXI水平與DVT的發(fā)生呈正相關(guān)［6］。在一項(xiàng)FXI活性水平與腦血管疾病的關(guān)系研究中，發(fā)現(xiàn)22%的卒中及短暫性腦缺血病人、18%的靜脈血栓病人的FXI活性水平高于95百分位的健康人群，即FXI水平升高可明顯增加腦卒中及靜脈血栓風(fēng)險(xiǎn)［7］。在有初發(fā)心肌梗死的560名男性(＜70歲)中，F(xiàn)XI水平最高人群的心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)是FXI水平最低人群的1.8倍［8］。FXI水平升高明顯增加?jì)D女(＜50歲)缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)，也輕微增加心肌梗死風(fēng)險(xiǎn)［9］。這些研究表明，F(xiàn)XI水平升高可促進(jìn)血栓性疾病的發(fā)生，如能抑制FXI則有可能減少血栓性疾病。

3 FXI基因敲除小鼠的血栓形成能力改變

3.1 FXI基因敲除小鼠與出血FVIII及FIX基因敲除小鼠容易出現(xiàn)自發(fā)性出血，F(xiàn)X、凝血酶原、FV及FVII基因敲除小鼠多會(huì)因引起出血而導(dǎo)致產(chǎn)前或產(chǎn)期死亡［3］，提示在人體中如果因抗栓需要而過(guò)度抑制這些凝血因子時(shí)，可能產(chǎn)生大量出血乃至危及生命的后果。但FXI基因敲除小鼠卻能健康存活，且繁殖力、止血功能與野生小鼠無(wú)異，也與FXI缺陷病人一樣表現(xiàn)出活化部分凝血活酶時(shí)間(aPTT)延長(zhǎng)而凝血酶原時(shí)間(PT)正常［10］。由此可見，針對(duì)FXI靶點(diǎn)的抗栓治療可能比針對(duì)FVIII、FIX、FV、FX、凝血酶及 FVII靶點(diǎn)的抗栓治療具有更好的安全性，在減少出血風(fēng)險(xiǎn)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

3.2 FXI基因敲除小鼠的抗栓作用在用不同濃度FeCl3誘導(dǎo)C57BL/6小鼠頸總動(dòng)脈血栓形成模型中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5% 的FeCl3誘導(dǎo)10 min能完全阻斷野生型小鼠血管，但在FXI基因敲除小鼠，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.0% 的FeCl3還不能完全阻塞血管，7.5% 的FeCl3僅能阻塞部分血管［11］。FXI基因敲除小鼠抗栓效果等同于高劑量肝素(1 000 U·kg-1)，比阿司匹林(100 mg·kg-1)更有效。在FeCl3誘導(dǎo)下腔靜脈血栓形成實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果與上述相似，而且FXI基因敲除小鼠抑制下腔靜脈血栓形成能力比高劑量肝素(1 000 U·kg-1)、氯吡格雷(30 mg·kg-1)、阿司匹林(100 mg·kg-1)或阿加曲班(30 mg·kg-1)更有效［12］。FXI基因敲除小鼠也能有效抑制激光損傷、擠壓損傷及結(jié)扎引起的血栓形成［10，13］。總的看來(lái)，F(xiàn)XI基因敲除小鼠能抑制動(dòng)脈及靜脈血栓形成，而且與幾種臨床應(yīng)用的抗栓藥物可能會(huì)引起小量出血相比較，F(xiàn)XI基因敲除小鼠的尾出血時(shí)間與野生型無(wú)差異［12］，同樣表明FXI可能是一個(gè)出血副作用小的抗栓防治靶點(diǎn)。

4 FXI抑制劑及其抗栓作用

目前已發(fā)現(xiàn)的FXI抑制劑還較少，主要包括單克隆抗體、反義寡核苷酸、小分子抑制劑、肽模擬物及肽類抑制劑等。

4.1 單克隆抗體

4.1.1 aXIMab aXIMab是一種鼠抗人FXI A3結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體［14］。給予狒狒靜脈注射2 mg·kg-1的aXIMab，在10天內(nèi)幾乎能完全抑制血漿FXI活性，并抑制凝血酶的形成和血小板的激活，減少動(dòng)靜脈旁路血栓中血小板沉積和血栓生成，而且不增加出血時(shí)間(BT)，在抗栓效果及出血時(shí)間方面均優(yōu)于32 mg·kg-1的阿司匹林［14］。

4.1.2 XI-5108 XI-5108是一種鼠抗人 FXI的單克隆抗體，其作用于 FXI/FXIa的輕鏈而抑制 FXa和 FXIa的活化［15］。靜脈注射3.0 mg·kg-1的 XI-5108 可明顯減少兔髂動(dòng)脈內(nèi)膜血栓的形成，而對(duì)PT、BT及血小板聚集均沒(méi)有影響［15］。

4.1.3 14E11 14E11是 FXI基因敲除 Balb/C鼠抗鼠 FXI的單克隆抗體，能有效抑制人、豬、家兔、狒狒、獼猴及大鼠等多種哺乳動(dòng)物血漿 FXI活性［16］。14E11與 FXI的A2結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，阻斷FXIIa活化FXI，但對(duì) FXIa的活性無(wú)影響。1.0 mg·kg-1的14E11可保護(hù)小鼠免于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的FeCl3誘導(dǎo)的血管阻塞，不會(huì)影響狒狒移植血管表面血小板的沉積，卻能降低移植血管0.4的纖維蛋白沉積量［16］。14E11還能降低小鼠敗血癥引起彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生，提高敗血病小鼠的生存率［17］。

前述幾種針對(duì)FXI靶點(diǎn)的單克隆抗體能抑制鼠、兔和狒狒等動(dòng)物的血栓形成，也均有出血風(fēng)險(xiǎn)小的優(yōu)勢(shì)，但單抗往往價(jià)格昂貴，而且這些抗體目前均還處于臨床前或候選藥物研究階段。此外，2 mg·kg-1的aXIMab幾乎完全抑制血漿FXI活性，因此，aXIMab的抗栓閾值還有待明確。

4.2 反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASO)目前已有多種FXI反義寡核苷酸(FXI ASO)的抗栓實(shí)驗(yàn)研究。50 mg·kg-1鼠FXI ASO，每周2次，連續(xù)3周給藥能降低98%鼠肝FXI mRNA及血漿FXI水平;FXI ASO使血漿aPTT延長(zhǎng)，但不影響PT;FXI ASO對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的FeCl3誘導(dǎo)的鼠下腔靜脈血栓、腸系膜靜脈血栓、降主動(dòng)脈血栓及狹窄誘導(dǎo)的下腔靜脈血栓形成均有很好抑制效果［18］。FXI mRNA減少60%～70%的水平就對(duì)FeCl3誘導(dǎo)的鼠下腔靜脈血栓有明顯抑制效果，而減少90%以上的FXI mRNA水平對(duì)鼠尾出血時(shí)間及手術(shù)出血時(shí)間均沒(méi)有影響［18］。FXI ASO在減少出血副作用方面不但明顯優(yōu)于華法林，而且其與LMWH(enoxaparin)或血小板聚集抑制劑-氯吡格雷(plavix)聯(lián)合用藥時(shí)，可增加抗栓效果，也不增加出血風(fēng)險(xiǎn)［18］。鼠FXI ASO能抑制ApoE基因敲除小鼠粥樣動(dòng)脈硬化的血栓形成，并能抑制炎癥反應(yīng)［19］。FXI ASO可使兔頸靜脈插入導(dǎo)管內(nèi)的阻塞性血栓形成時(shí)間延長(zhǎng)2.3倍［20］。

ISIS 416858是根據(jù)人和獼猴FXI設(shè)計(jì)的ASO，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。連續(xù)13周皮下注射不同劑量ISIS 416858，獼猴肝FXI mRNA水平及血漿FXI活性與給藥劑量呈依賴關(guān)系。每周給予40 mg·kg-1劑量，在第4周時(shí)，血漿FXI活性下降80%，延長(zhǎng)33%aPTT，連續(xù)給藥13周，動(dòng)物BT、PT均正常［21］。FXI ASO使狒狒血漿FXI活性下降50%時(shí)，能抑制40% ～50%的血栓生成;25 mg·kg-1劑量，每周3次，連續(xù)3周可使血漿FXI活性下降約50%，且不增加出血風(fēng)險(xiǎn)［22］。在對(duì) ISIS 416858(即 ISIS-FXIRx)的臨床I期試驗(yàn)中，受試者FXI活性出現(xiàn)持續(xù)的、劑量依賴地減少，并伴隨著aPTT延長(zhǎng)，即使體內(nèi)FXI降至不能被檢測(cè)的水平時(shí)，也不會(huì)出現(xiàn)與藥物相關(guān)的出血癥狀［22］。ISIS-FXIRx對(duì)受試者心電圖、肝功能及腎功能也沒(méi)有明顯影響［22］。在最近的臨床II期試驗(yàn)中，觀察了ISIS-FXIRx對(duì)全膝關(guān)節(jié)置換病人中VTE的防治及出血的影響(NCT01713361)(2014年8月完成)［23］，但結(jié)果還沒(méi)有公開。

從目前的研究看，F(xiàn)XI ASO非常有望發(fā)展成為出血副作用小的抗栓新藥，但FXI ASO起效較慢，需要數(shù)周時(shí)間才能形成抗栓效果，在作為防治藥物時(shí)可能會(huì)受到一定限制。

4.3 小分子抑制劑已發(fā)現(xiàn)的FXI小分子抑制劑主要包括4-羧基-2-氮雜環(huán)丁酮(BMS-262084)、分離自海綿的Clavatadine A和B、以及硫酸五沒(méi)食子酰葡萄糖苷、單硫酸苯并呋喃、四氫喹啉和芳烴硼酸等的衍生物。BMS-262084抑制FXIa活性很強(qiáng)(IC50=2.8 nmol·L-1)，比其他凝血因子選擇性高70倍以上;延長(zhǎng)正常人和大鼠血漿2倍aPTT時(shí)，對(duì)PT無(wú)影響［24］。BMS-262084能抑制FeCl3誘導(dǎo)的大鼠頸總動(dòng)脈和深靜脈血栓、生理電刺激誘導(dǎo)兔頸動(dòng)脈血栓、動(dòng)靜脈旁路血栓的生成，但對(duì)組織因子引起的血栓無(wú)影響;高出2倍有效劑量的BMS-262084不會(huì)影響大鼠表皮、腸系膜及腎皮質(zhì)的出血時(shí)間［24］。但BMS-262084對(duì)類胰蛋白酶也有較強(qiáng)的抑制作用(IC50=4.0 nmol·L-1)，因此，需要進(jìn)一步提高其抑制FXIa特異性。對(duì)其他FXI小分子抑制劑還缺少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

4.4 多肽/蛋白類抑制劑蛋白酶連接素 2(PN2)的蛋白酶抑制活性部位 PN2KPI由57個(gè)氨基酸殘基組成，在人體生理滅活FXIa中發(fā)揮了重要作用，對(duì)FXIa有很強(qiáng)的抑制活性(Ki=0.81 nmol·L-1)，對(duì)其他凝血因子如 FVIIa、FIXa 及纖溶酶等抑制活性很弱(Ki＞400 nmol·L-1)，但對(duì)胰蛋白酶有很強(qiáng)的抑制活性(Ki=0.03 nmol·L-1)［25］。利用 FeCl3誘發(fā)小鼠頸動(dòng)脈血栓和小鼠大腦中動(dòng)脈血栓(MCAO)模型，證實(shí)了PN2KPI能有效防止血栓的形成且不引起出血［26］。PN2KPI作為人體生理性多肽，可能具有較好的人體安全性，但也可能被人體組織內(nèi)的中胰蛋白酶降解而失活，其對(duì)胰蛋白酶具有更強(qiáng)的抑制活性是否會(huì)限制其在人體應(yīng)用也還需要研究。

最近，從吸血生物-鉤蟲、蜱及吸血蝙蝠(desmodus rotundus)［27］中也分別分離到對(duì) FXIa具有較好抑制作用的多肽/蛋白，但他們同時(shí)還能抑制其他凝血因子或蛋白酶。我們課題組報(bào)道了鉤蟲抗凝肽AduNAP4及AcaNAP10對(duì)FXIa有較強(qiáng)抑制作用［28］，并對(duì)AcaNAP10進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得了FXIa的特異性抑制劑，目前正作為I類新藥在進(jìn)行臨床前研究。

4.5 肽模擬物L(fēng)in等［29］研發(fā)了基于酮精氨酸的系列FXIa肽模擬物(peptidomimetics)抑制劑，其最有效的抑制劑的IC50約為 6 nmol·L-1，延長(zhǎng) 2 倍 aPTT 約需 2.4 μmol·L-1，對(duì)小鼠靜脈血栓形成抑制效果較好，但無(wú)有關(guān)后續(xù)報(bào)道。

4.6 其他抑制劑除PN2外，人體內(nèi)還存在其他一些生理性FXIa抑制物，包括α1抗胰蛋白酶(α1-AT)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、C1 抑制物(C1-Inh)、α2 抗纖溶酶(α2-AP)及 PN1等［30］，但他們均是廣譜的絲氨酸蛋白酶抑制劑，同時(shí)還對(duì)體內(nèi)其它多種凝血因子或蛋白酶具有抑制作用。進(jìn)一步了解這些抑制劑抑制FXIa的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，或許可為設(shè)計(jì)新的高效、特異性FXI抑制劑提供參考。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

FXI在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大過(guò)程和內(nèi)源性途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與血栓性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。高水平血漿FXI人群腦卒中及DVT發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，F(xiàn)XI缺陷病人DVT及腦卒中發(fā)病率降低，F(xiàn)XI基因敲除鼠能抑制多種物理及化學(xué)因素導(dǎo)致的血栓形成，表明FXI可以作為抗栓治療新靶點(diǎn)。而FXI缺陷病人出血溫和，F(xiàn)XI基因敲除鼠止血功能正常的特點(diǎn)又意味著抑制FXI靶點(diǎn)出血風(fēng)險(xiǎn)低。目前已研發(fā)了單抗、反義寡核苷酸、多肽及化學(xué)小分子等FXI抑制劑，但還比較少。單抗、反義寡核苷酸目前還存在著價(jià)格昂貴、起效慢、可能不易控制等不足，因此，研發(fā)特異性好、活性強(qiáng)的FXI多肽或小分子抑制劑值得期待。雖然已有的FXI抑制劑對(duì)小鼠、大鼠、兔及靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)的血栓形成有較好的抑制效果，且出血副作用小，但在人體內(nèi)的抗栓效果及副作用還需要進(jìn)一步觀察?？偟目磥?lái)，F(xiàn)XI是近年來(lái)才引起關(guān)注的具有出血風(fēng)險(xiǎn)小的抗栓防治新靶點(diǎn)，針對(duì)該靶點(diǎn)的新藥可能能彌補(bǔ)目前臨床抗凝抗栓藥物易出現(xiàn)出血并發(fā)癥的不足，將可能產(chǎn)生具有重大影響的重磅新藥。

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