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實驗研究

補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞增殖活性及細胞周期影響的實驗研究*

河北省中醫(yī)院口腔科(石家莊 050011)

高毅刁志虹△李敏王彥敏△△穆春暉△△△何源王雙雙李立芳

提要目的：觀察補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1細胞)增殖活性及細胞周期變化的影響，探討該方劑治療牙周炎的作用機理。方法：MC3T3-E1 細胞分別于5%、10%、15%、20%補腎活血固齒方含藥血清，10%無藥血清，10%胎牛血清中培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，MTT法檢測補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響。另外MC3T3-E1 細胞分別于10%補腎活血固齒方含藥血清、無藥血清、胎牛血清中培養(yǎng)24、48、72 h，用流式細胞儀檢測該方劑對MC3T3-E1細胞細胞周期的影響。結果：含藥血清與胎牛血清、無藥血清組相比，MC3T3-E1細胞增殖活性及細胞周期差異無顯著性(P>0.05)。結論：補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞增殖活性及細胞周期無影響，其可能是通過促進該細胞向成骨細胞分化、促進牙槽骨的再生而發(fā)揮藥物作用。

關鍵詞補腎活血固齒方；牙周炎；小鼠顱頂前成骨細胞；MTT；增殖活性；作用機理；細胞周期

Empirical Study on effect of Kidney-tonifying Blood-activating and

Tooth-astringing Formula on Multiplication Activity and Cell

Cycle of Mice Calvaria Preosteoblasts

Stomatological Department of Hebei TCM Hospital (Shijiazhuang 050011)

GAOYiDIAOZhi-hongLIMinWANGYan-minMUChun-huiHEYuanWANGShuang-shuangLILi-fang

Abstract Objective: to observe the effect of Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula on MC3T3-E1 multiplication activity and the cell cycle, and to explore the functional mechanism of the formula in treating periodontitis. Methods: MC3T3-E1 were cultured respectively in formula serum of 5%, 10%, 15% and 20%, 10% pure serum, and 10% fetal bovine serum for 12, 24, 36, 48, 60 and 72 hours. MIT method was used to detect the effect of the formula on MC3T3-E1 multiplication activity. Besides, MC3T3-E1 were cultured respectively in 10% formula serum, pure serum and fetal bovine serum for 24, 48 and 72 hours, and the flow cytometer was used to detect the effect of the formula on the MC3T3-E1 cycle. Results: compared to pure serum and fetal bovine serum, there was no significant difference between MC3T3-E1 multiplication activities and the cell cycles in the formula serum (P>0.05). Conclusion: Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula has no effect on MC3T3-E1 multiplication activity and the cell cycle, but it may work by facilitating its osteoblast differentiation and promoting the alveolar bone regeneration.

Key words Kidney-tonifying Blood-activating and Tooth-astringing Formula; periodontitis; mouse calvaria preosteoblasts; MIT; multiplication activity; functional mechanism; cell cycle

牙周炎是口腔科的常見病，多發(fā)病，是導致成年人牙齒喪失的主要原因，不僅危害口腔健康，并可導致和誘發(fā)各種全身性疾病，嚴重影響人類的健康。我科多年來應用補腎活血固齒方治療牙周炎，療效顯著，但其作用機理不明了。本實驗應用補腎活血固齒方含藥血清作用于小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1細胞)，觀察該方劑對細胞增殖及細胞周期的影響，探討補腎活血固齒方治療牙周炎的作用機理。

*河北省科技支撐計劃項目：No.13277730D；河北省中醫(yī)藥管理局資助項目：No.2014028

△河北省石家莊市第一醫(yī)院口腔科

△△河北省石家莊市第三醫(yī)院口腔科

△△△北京市東城區(qū)第一人民醫(yī)院

1實驗材料

1.1試劑與儀器α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)，胎牛血清(PAA Laboraties GmbH)， 胰酶(Amresco)，EDTA(天津市永大化學試劑開發(fā)公司)，葉酸(Amresco)， β-疏基乙醇(北京鼎國生物技術有限責任公司)，肌醇(北京索萊寶科技股份有限公司)，戊巴比妥(華北制藥有限公司股份)，Triton x-100(Solarbio)， MTT(BIOSHARP)，DMSO(Dimethyl Sulphoxide)，碘化丙錠(Sigma公司)。

HF240二氧化碳培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司)，BSC-1100ⅡA2生物安全柜(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)，TE2000-U熒光倒置顯微鏡(日本NiKon公司)，B40型醫(yī)用低速離心機(安新縣白洋離心機廠)，D-37520高速離心機(Thermo ELECTRON CORPORATION)，HKA-A2450-230精密電子天平(意大利BEL Engineering公司)Type354酶標儀(Thermo ELECTRON CORPORATION )，SHAL水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市江南儀器)，EPICS XL 流式細胞儀(BECKMAN COULTER)

1.2實驗動物清潔級健康雄性SD系大鼠，280～300 g 20只，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(冀)2008-1-033。飼養(yǎng)條件室溫保持在18℃～25℃，空氣流通，12 h維持光照，動物在籠中自由攝食飲水。飼料由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.3小鼠顱頂前成骨細胞(MC3T3-E1細胞)的培養(yǎng)MC3T3-E1細胞購自中國科學院上海細胞庫，吸去原培養(yǎng)液，PBS溶液清洗 2 遍，加入 0.25%胰酶 1 mL，37℃消化 1 min，加α-MEM培養(yǎng)基1.5 mL終止消化，反復吹打細胞，使其懸浮，移至15 mL離心管，1 000 r/min離心5 min，吸去上清液，加入培養(yǎng)基4.5 mL，輕輕吹打，使管底細胞懸浮，均勻分散。取3個培養(yǎng)瓶，向每個培養(yǎng)瓶中滴入細胞懸液1.5 mL，3個培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，每3 d換液1次。培養(yǎng)5～6 d，細胞鋪滿瓶底 70%～80%時處于對數生長期，用于下一步實驗。

1.4中藥成分及藥劑制備藥物組成：淫羊藿、補骨脂各15 g，熟地黃、當歸、丹參、知母各10 g，甘草3 g。藥劑制備：藥物加10倍量蒸餾水煎煮1.5 h，過濾；加同量蒸餾水重煎1.5 h，過濾。合并濾液濃縮至150 mL，裝袋備用。

2實驗方法

2.1實驗分組實驗分為3組：含藥血清組、無藥血清組、胎牛血清組。(1)含藥血清組血清來自10只280～300 g SD大鼠，按體表面積的方法折算人體等效計量，按4.875 g生藥/kg體質量計算用藥量，每日灌胃2次，連續(xù)灌胃7 d，最后1 d第2次灌胃后間隔2 h再次灌胃，于末次給藥后1 h，1.2%戊巴比妥麻醉大鼠，經腹主動脈采血。每只大鼠的血液置于不同離心管中，冷置1 h后，3 000 r/min離心20 min，將同組各只大鼠離心管中的上清液置于同一離心管中混合以減少不同大鼠的個體差異， 56℃滅活30 min，濾菌器抽濾除菌后分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)無藥血清組大鼠等劑量生理鹽水灌胃，血清制備方法同前。(3)胎牛血清組的血清是直接購買于PAA Laboraties GmbH。

2.2MTT法檢測補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響取一部分細胞，調整細胞密度為5×107/L，每孔100 μL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中48 h后，換用含藥血清組(分別含有5%、10%、15%、20%含藥血清)、胎牛血清組(含10%胎牛血清)、無藥血清組(含10%無藥血清)，每種血清設9個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，分別于不同時間點的各孔中加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清，每孔中加入75 μL DMSO，搖床震蕩15 min。酶聯免疫測試儀上測定492 nm波長的每孔細胞OD值。

2.3流式細胞術檢測補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞細胞周期的影響將處于對數生長期的MC3T3-E1細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，接種于50 mL細胞培養(yǎng)瓶中，每組接種15瓶，37℃ ，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。2 d后將原培養(yǎng)液吸出，PBS清洗2次，分別加入10%含藥血清、無藥血清、胎牛血清的培基培養(yǎng)細胞。收集培養(yǎng)24、48、72 h的細胞，PBS溶液清洗2遍。用0.25%的胰酶消化，離心沉淀，棄上清。緩慢加入預冷(保存于4°C)的70%乙醇固定細胞，充分混勻，4°C靜置30 min。上機前離心去除固定液，加入含1%RNA酶的碘化丙啶染色液1 mL，4℃避光染色30 min，經300目尼龍網過濾，上機檢測。采用流式細胞儀測定細胞各增殖周期時相的DNA百分含量，打印DNA含量分布組方圖，自動擬合出細胞周期各時相比例,以增殖系數(PI)表示細胞分裂增殖情況。I=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。

3結果

3組細胞增值活性均隨時間的延長而增加，含藥血清與胎牛血清、無藥血清組相比，MC3T3-E1細胞增殖活性差異無顯著性(P>0.05)，詳見表1；含藥血清組、無藥血清組、胎牛血清組的PI值差異無顯著性(P>0.05)，詳見表2。表明補腎活血固齒方對MC3T3-E1細胞的細胞周期無影響。

表1　　不同血清組細胞活性　

表2　　補腎活血固齒方對小鼠顱頂前成骨細胞增殖指數 (PI值)影響

4討論

牙周炎是侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性破壞性疾病,在世界范圍內有較高患病率,在我國更為突出,高達95%，[1]是致使成年人牙齒喪失的主要原因,并可導致或誘發(fā)全身性疾病,嚴重危害人類健康。牙周炎是一種病因及發(fā)病機理不明的感染性疾病，主要是致病菌和肌體反應性。[2 ]本病相當于中醫(yī)的“齒豁”，中醫(yī)認為其病因病機可歸為脾胃濕熱、腎陰虧損或氣血不足。中醫(yī)辨證施治慢性牙周炎在臨床上療效確切，彌補了西醫(yī)主要針對細菌及局部因素治療的局限性。[3]李敏等將慢性牙周炎患者180例，隨機分為2組，治療組120例，對照組60例。對照組行牙周基礎治療，治療組在對照組治療基礎上進行辨證為脾胃濕熱型、腎陰虧損型、氣血不足型3型分別進行治療。結果發(fā)現脾胃濕熱型占25.83%，腎陰虧損型占57.5%，氣血不足型占16.67%。治療組的總有效率為97%，對照組的總有效率為60%，治療組療效明顯優(yōu)于對照組，中西醫(yī)結合，辨證施治牙周炎，即改善消除局部病損，又調節(jié)全身狀況、標本兼治，療效滿意。[4]

根治牙周炎的關鍵是能否阻止牙槽骨吸收或促進牙槽骨再生。牙槽骨是人體骨骼中代謝最活躍的組織，[5]牙槽骨代謝的穩(wěn)定依賴于成骨細胞和破骨細胞的平衡。因此治療牙周炎的藥物,無論治療機制如何,最終必須通過骨的微環(huán)境、成骨細胞和破骨細胞而起調節(jié)作用。

細胞增殖是細胞的基本屬性，研究藥物對細胞的作用首先觀察其對細胞增殖能力的影響。成骨細胞的增殖表現為細胞數量增加，形成多層細胞。典型的成骨細胞周期時間為20～24 h。[6]目前有關補腎中藥對成骨細胞增殖影響的研究結論不一。邵敏通過MTT法研究中藥骨康及其補腎、健脾、活血各成分的含藥血清對大鼠成骨細胞增殖的影響，發(fā)現骨康血清能促進成骨細胞的增殖,補腎成分血清也能促進成骨細胞的增殖，健脾、活血各成分血清對成骨細胞增殖無明顯影響。[7]朱曉峰發(fā)現不同濃度(1 μmol/L、0.1 μmol/L和0.01 μmol/L)的淫羊藿素對MC3T3-E1細胞的增殖均無影響。[8]本研究發(fā)現不同濃度補腎固齒方含藥血清對MC3T3-E1細胞增值均無明顯影響；隨著時間的延長，細胞增殖能力有所增加，但和胎牛血清、無藥血清相比差異無顯著性。

對成骨細胞增殖的調控即是對細胞周期的調控，細胞周期就是從細胞分裂產生的新細胞生長開始到下一次細胞分裂形成子細胞結束為止所經歷的過程，主要分為G0、G1、S、G2及M期。處于不同細胞周期的細胞，DNA含量不同，處于G0和G1期的細胞含有二倍體量的DNA,處于S期的細胞含有從二倍體量至四倍體量的DNA,處于G2及M期的細胞含有四倍體量的DNA。利用熒光染料與細胞內的DNA結合，通過流式檢測就能反映細胞內DNA含量，區(qū)分細胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期，并由此得出可用來反映細胞增殖情況的增殖指數PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) 。[9]PI值是指處于S期和G2/M期細胞占所有細胞的比例，PI值越高，表明細胞增殖越活躍。本實驗結果顯示含藥血清組的PI值與無藥血清組及胎牛血清組相比無明顯差異，提示我們補腎活血固齒方不是通過促進細胞增殖來促進骨形成的，其可能是通過促進該細胞向成骨細胞分化、促進牙槽骨的再生而發(fā)揮治療牙周炎藥物作用。

參考文獻

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[2]李元聰.中西醫(yī)結合口腔科學[M] .北京 ：中國中醫(yī)藥出版社，2005.98

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[4]李敏 ，高毅，王競超，等. 慢性牙周炎的中醫(yī)辨證施治臨床研究[J]. 河北中醫(yī)藥學報，2015,30(2):25-27

[5]曹采方.牙周病學[M]. 2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,

2003.35-83

[6]童安莉，陳璐璐，丁桂芝.成骨細胞骨形成機制研究進展[J]. 中國骨質疏松雜志，1999,5(3)：60-64

[7]邵敏，趙靜，王斌. 不同中藥含藥血清對體外培養(yǎng)成骨細胞影響的實驗研究[J].中國中醫(yī)骨傷科雜志，2006，14(5):19-21

[8]朱曉峰，張榮華，孫升云.淫羊藿素通過雌激素受體和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號誘導MC3T3-subclone14分化[J].中國病理生理雜志，2011,27(12):2 351-2 356

[9]陳朱波，曹雪濤.流式細胞術[M].北京：科學出版社，2010.142-146

(2015-09-15收稿)

通訊作者：李敏，女，碩士。

中圖分類號：R285.5

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5615(2015)04-0001-04