陳龍正，徐 海，宋 波，袁希漢

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南京210014）

不結(jié)球白菜抗根腫病漸滲系的分子輔助選育

陳龍正，徐 海，宋 波，袁希漢＊

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，南京210014）

該研究基于與大白菜抗根腫病連鎖的分子標(biāo)記，設(shè)計(jì)特異引物，獲得簡(jiǎn)便實(shí)用的SCAR標(biāo)記，并用于分子標(biāo)記輔助選擇，創(chuàng)制不結(jié)球白菜抗根腫病新材料。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在設(shè)計(jì)的8對(duì)特異引物中，有1對(duì)特異引物在抗、感親本間表現(xiàn)出多態(tài)性。F2群體驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記與已有SSR標(biāo)記及根腫病抗性共分離，能夠用于抗根腫病鑒定，定名為CRb－R－25。通過亞種間雜交并回交，利用標(biāo)記CRb－R－25輔助選擇將大白菜根腫病抗性轉(zhuǎn)入不結(jié)球白菜中，獲得抗根腫病不結(jié)球白菜漸滲系材料TQ14－1－15。

不結(jié)球白菜；抗根腫?。籗CAR標(biāo)記；輔助選擇

不結(jié)球白菜（Brassica campestris ssp.chinensis）起源于中國(guó)，是國(guó)內(nèi)尤其是南方重要的綠葉菜之一。根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的一種世界性病害。以往關(guān)于抗根腫病的研究主要集中在大白菜和甘藍(lán)上［1－2］，近年來，由于不結(jié)球白菜栽培效益好，復(fù)種指數(shù)高，土傳病害逐漸成為制約不結(jié)球白菜發(fā)展的重要因素，根腫病由過去不常見的病害逐漸顯露出來，并呈蔓延趨勢(shì)。然而，由于不結(jié)球白菜抗根腫相關(guān)研究起步較晚，目前國(guó)內(nèi)外還未發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜根腫病抗源。通過種間或亞種間漸滲雜交可以為育種提供新的種質(zhì)資源，目前已在多種作物上建立起了不同類型的漸滲系，如小麥［3］、棉花［4］、水稻［5］、玉米［6］等主要大田作物，在這些作物上已經(jīng)獲得能夠直接用于作物品種改良的遺傳穩(wěn)定的漸滲系。

大白菜與不結(jié)球白菜之間的亞種間雜交親和性較高，因此，可通過將大白菜抗根腫病基因?qū)氩唤Y(jié)球白菜，提高不結(jié)球白菜根腫病抗性。但是，一方面種間雜交往往導(dǎo)致性狀的劇烈分離而不易選擇，另一方面由于根腫病為土傳病害，易受環(huán)境影響，不易控制，接種鑒定比較困難。因此，開發(fā)抗根腫病特異分子標(biāo)記，對(duì)提高育種效率，開展分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。Piao等［7］利用SSR標(biāo)記TCR01和TCR09，將抗根腫病CRb基因定位在大白菜A3連鎖群并且標(biāo)記間遺傳距離為2.9cM。陳慧慧等［8］根據(jù)Piao等［7］的研究開發(fā)了2個(gè)大白菜SSR標(biāo)記，分別為TCR13和TCR74，標(biāo)記間遺傳距離為0.18cM，這些研究為大白菜抗根腫病分子標(biāo)記輔助育種提供了理論基礎(chǔ)。本研究利用攜帶CRb基因的大白菜種質(zhì)，與不結(jié)球白菜進(jìn)行亞種間雜交和回交，通過已有的SSR標(biāo)記設(shè)計(jì)特異引物，以期獲得更為簡(jiǎn)便快速的SCAR標(biāo)記應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇，同時(shí)結(jié)合大白菜與不結(jié)球白菜亞種間雜交創(chuàng)制不結(jié)球白菜抗根腫病新種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

供體母本為攜帶CRb基因的大白菜材料CCR13025，對(duì)根腫病表現(xiàn)為高抗，從云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所引進(jìn)。父本材料‘T青’，為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究提供。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)田。F1代自交獲得F2，用于標(biāo)記準(zhǔn)確性鑒定。以‘T青’為輪回親本連續(xù)回交，從BC1代開始，根據(jù)分子標(biāo)記進(jìn)行選擇，選擇性狀接近輪回親本并且含有CRb基因的單株用于回交，獲得回交后代群體BC3。

1.2 方 法

1.2.1 各世代植株抗性鑒定 ‘T青’、CCR13025、F1、F2及BC1～BC3。每個(gè)材料每次30株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列，播種于50孔穴盤。接種方法及評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同張慧等［9］。

1.2.2 多態(tài)性標(biāo)記開發(fā) 在大白菜基因數(shù)據(jù)http：／／brassicadb.org／cgi－bin／gbrowse／Brassica＿ v1.5中定位已報(bào)道的2個(gè)SSR標(biāo)記TCR13（上游0.09cM）和TCR74（下游0.09cM）［8］，獲得物理區(qū)域?yàn)锳3染色體Bra23787138～Bra23847142之間，在該區(qū)間中間設(shè)計(jì)了8對(duì)特異引物（表1），委托上海生物工程公司進(jìn)行引物的合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 采用CTAB法提取幼嫩葉片DNA。利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性和純度，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，并稀釋至15ng／μL。

20μL反應(yīng)體系中含1×PCR緩沖液、2.0 mmol／L MgCl2、2.0mmol／L dNTP、15ng DNA、2條引物各0.5μmol／L，1UTaq酶，用ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，53℃退火1min，72℃延伸2min；40個(gè)循環(huán)，72℃保溫延伸5min，4℃下保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在培清凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照記錄。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC－100PCR儀上進(jìn)行。

2個(gè)SSR標(biāo)記TCR13和TCR74反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參考陳慧慧等［8］，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗根腫病SCAR分子標(biāo)記的開發(fā)

利用2個(gè)標(biāo)記TCR13和TCR74的SSR引物進(jìn)行雙親及雜交、自交分離后代鑒定，發(fā)現(xiàn)在大白菜抗源CCR13025和雜種F1中分別攜帶2個(gè)標(biāo)記，不結(jié)球白菜‘T青’未檢到。該標(biāo)記在78個(gè)F2代分離群體中按照3∶1（59∶19）的分離比例進(jìn)行分離（圖1），并且2個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出嚴(yán)格的共分離現(xiàn)象，標(biāo)記與實(shí)際接種鑒定結(jié)果相吻合，表明該標(biāo)記能夠用于抗根腫病材料的分子標(biāo)記輔助選擇。

在大白菜基因數(shù)據(jù)庫(kù)http：／／brassicadb.org／cgi－bin／gbrowse／Brassica＿v1.5中定位2個(gè)SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其分別位于大白菜A3染色體Bra23787138～Bra23847142之間，物理距離10006bp，在該區(qū)間設(shè)計(jì)了8對(duì)特異引物（表1），進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在8對(duì)特異引物中，有7對(duì)在雙親和F1中沒有多態(tài)性，1對(duì)引物B12525在雙親和F1之間有多態(tài)性（圖2）。將該多態(tài)性引物用F2群體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記與TCR13和TCR74共分離，并且與田間接種鑒定一致（圖3），在所有表現(xiàn)抗性的單株中均能擴(kuò)增到該標(biāo)記，在感病單株中表現(xiàn)缺失。表明該SCAR標(biāo)記能夠用于抗根腫病分子標(biāo)記輔助選擇，命名為CRb－R－25。

2.2 不結(jié)球白菜抗根腫病回交后代分子選擇

利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，以不結(jié)球白菜‘T青’為輪回親本，進(jìn)行回交并用CRb－R－25進(jìn)行選擇，每代選取10株表型性狀最接近‘T青’并且攜帶標(biāo)記CRb－R－25的單株作為種株留種，在每個(gè)回交世代中做自交分離，淘汰自交后代CRb－R－25標(biāo)記發(fā)生分離的單株（其回交后代抗性位點(diǎn)為雜合的Aa類型），選擇純合的進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育（抗性位點(diǎn)純合AA類型）?；亟?代后，BC3表型性狀為典型的不結(jié)球白菜性狀，大白菜原有的葉翼、葉片絨毛、白梗、包心等性狀均已改良，綜合性狀基本接近輪回親本‘T青’，漸滲系與輪回親本理論遺傳物質(zhì)相似度為96.9%。將輪回親本‘T青’和BC3接種根腫病菌35d后檢測(cè)，結(jié)果表明，‘T青’在根部形成腫瘤，為典型的根腫病病癥，而攜帶CRb－R－25條帶的BC3單株TQ14－1－15表現(xiàn)抗病，根部發(fā)育正常（圖4）。

3 討 論

利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇具有操作簡(jiǎn)便、速度快、不受環(huán)境影響等優(yōu)勢(shì)，十字花科根腫病為十字花科重要的土傳病害，在接種鑒定中受溫度、濕度、pH值等環(huán)境因素的影響較大［10］。Piao等［7］開發(fā)了2個(gè)與大白菜抗根腫病CRb基因連鎖的分子標(biāo)記，TCR05和TCR09連鎖距離為2.71cM。陳慧慧等［8］根據(jù)TCR05和TCR09等2個(gè)連鎖標(biāo)記，結(jié)合大白菜基因組序列信息，開發(fā)了TCR13（上游0.09cM）和TCR74（下游0.09cM）2個(gè)SSR標(biāo)記，并將遺傳距離定位在0.18cM內(nèi)。在本研究中，基于大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，將2個(gè)SSR標(biāo)記TCR 1 3和TCR74定位在大白菜A3染色體Bra23787138～Bra23847142之間。在本區(qū)間中設(shè)計(jì)了8條特異引物，其中1對(duì)引物與SSR標(biāo)記TCR13和TCR74共分離，表明將其成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，命名為CRb－R－25。經(jīng)接種鑒定驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記能夠用于分子標(biāo)記輔助選擇。

在分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行抗根腫病性狀轉(zhuǎn)育方面，樸鐘云等［11］利用Piao等［7］開發(fā)的2個(gè)與大白菜抗根腫病CRb基因連鎖的分子標(biāo)記TCR01和TCR09，進(jìn)行大白菜與大白菜之間的抗性轉(zhuǎn)育，獲得9個(gè)‘BJN3’的近等基因系。目前在不結(jié)球白菜研究中未發(fā)現(xiàn)根腫病抗源，本研究利用抗根腫病大白菜與不結(jié)球白菜進(jìn)行亞種間雜交和回交，經(jīng)過3代，利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，在回交過程中大白菜典型性狀如葉毛、葉翼、包心等逐漸在各世代丟失，回交后代綜合性狀趨于輪回親本，最終獲得了攜帶根腫病抗性的不結(jié)球白菜種質(zhì)資源TQ14－1－15，實(shí)現(xiàn)了提高育種效率的目的。

本研究中，通過對(duì)大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，在A3染色體Bra23787138～Bra23847142之間，共計(jì)有9個(gè)功能基因，這些基因既有編碼細(xì)胞膜組分蛋白，也有編碼蛋白質(zhì)合成調(diào)控蛋白，下一步根據(jù)結(jié)合抗性鑒定，分析這些基因與根腫病抗性之間的關(guān)系，將有利于根腫病抗性基因的分離和克隆。

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（編輯：宋亞珍）

Marker－assisted Breeding of Clubroot Resistant Introgression Line in Non－h(huán)eading Chinese Cabbage

CHEN Longzheng，XU Hai，SONG Bo，YUAN Xihan＊
（Institute of Vegetable Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

We designed SCAR markers according to the markers linked to clubroot resistant gene in Chinese cabbage，in order to develop the new clubroot resistant materials of non－h(huán)eading Chinese cabbage through marker－assisted selection（MAS）.The results indicated that one pair primer among 8showed polymorphism between parents of resistant and susceptible，and co－segregation with reported SSR marker and resistant characterization of F2，suggested that it could be used to identify the clubroot resistance，named CRb－R－25.Based on the inter－subspecies hybrid，backcross and selection of CRb－R－25，TQ14－1－15with clubroot resistance of non－h(huán)eading Chinese cabbage was bred by introgression of resistance gene in Chinese cabbage.

non－h(huán)eading Chinese cabbage；clubroot resistance；SCAR；marker assisted－selection

Q789

A

1000－4025（2015）08－1530－04

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1530

2015－05－05；修改稿收到日期：2015－06－10

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20130715）；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201403032）。

陳龍正（1980－），男，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E－mail：lzchen＠jaas.ac.cn

＊通信作者：袁希漢，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E－mail：xhyuan258＠163.com