易 嵐，李林蔚，譚 暉，何 潔，胡勁松，謝紅艷，蘇 琦

（南華大學(xué)1.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院、2．腫瘤研究所，湖南衡陽(yáng) 421001）

DADS對(duì)人白血病細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用比較研究

易 嵐1，2，李林蔚1，譚 暉2，何 潔2，胡勁松1，謝紅艷1，蘇 琦2

（南華大學(xué)1.藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院、2．腫瘤研究所，湖南衡陽(yáng) 421001）

A comparative study of apoptosis in diallyl disul-fide-induced human leukemia cells and lymphoma cells

YI Lan1，2，LI Lin-wei1，TAN Hui2，HE Jie2，HU Jing-song1，XIE Hong-yan1，SU Qi2
（1．College of Pharmacy and Biological Sciences，2．Cancer Re-search Institute，University of South China，Hengyang，Hunan，421001，China）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－10－16 9：52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20151016．0952．060．html

大蒜及其烯丙基硫化物的抗腫瘤作用正日益受到關(guān)注［1－2］。我們的前期研究顯示，DADS對(duì)人白血病HL-60細(xì)胞具有雙效作用，小劑量DADS（＜1.25 mg·L－1）誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞分化，而中等劑量DADS（＞1．25 mg·L－1）可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡［3－4］。我們的前期研究表明，Rac2與DADS誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞凋亡相關(guān)［5］，且DADS通過(guò)活性氧介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡，且NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程ROS的主要來(lái)源［6－7］。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，比較DADS對(duì)人早幼粒白血病系HL-60細(xì)胞、人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞、人何杰金式淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞的增殖抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)也比較了DADS對(duì)這3種細(xì)胞活性氧產(chǎn)生以及Rac2的表達(dá)的影響。為進(jìn)一步闡明DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡治療提供新思路。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 DADS為Fluka公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；2′，7′-二氯氫化熒光素二脂（DCFH-DA），Rac2等一抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品（sc-96）。二抗（sc-2774）為Abcam Biotechnology公司產(chǎn)品。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)采用常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，飽和濕度，5%CO2，每3－4天換液傳代。

1．2．2MTT檢測(cè) 細(xì)胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)72 h。于結(jié)束前4 h除對(duì)照組外，每孔加MTT溶液孵育4 h，終止培養(yǎng)。離心棄上清。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)各孔吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm，按下列公式計(jì)算抑制率（IR%）。IR%＝（1－實(shí)驗(yàn)組OD570／對(duì)照組OD570）×100%。

1．2．3RT-PCR檢測(cè) 利用Primer Premier 5．0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。β-actin正義引物序列為5′-CCTGTACGCCAACA-CAGTGC-3′，反義引物序列為：5′-ATACTCCTGCTTGCT-GATCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為211 bp；RAC2正義引物序列為：5′-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3′，反義引物序列為：5′-GATG-GTGTCCTTGTCGTCC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為143 bp。提取細(xì)胞總RNA；cDNA合成；PCR反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1．2．4細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè) 收集細(xì)胞，加入DCFH-DA充分混勻，常溫避光反應(yīng)50 min，洗滌細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞，37℃條件下水浴10 min，流式細(xì)胞儀分析熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。

1．2．5Western blot檢測(cè) 細(xì)胞裂解：分別收集各組細(xì)胞，加入裂解液，冰上裂解，獲細(xì)胞總蛋白。蛋白變性，電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉，孵一抗，洗膜，孵二抗，洗膜后，化學(xué)發(fā)光劑檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡，薄層掃描儀測(cè)定印跡區(qū)帶的光密度值。

1．2．6凋亡細(xì)胞百分率檢測(cè) 收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS重懸，離心。用75%乙醇固定細(xì)胞，加碘化丙啶（PI），避光振蕩混勻，DNA含量低于2n的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為凋亡細(xì)胞百分率。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，Student′t-test法進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)值用±s表示。

2　結(jié)果

2．1DADS對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞增殖抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DADS以劑量依賴方式抑制這3種細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，DADS作用HL-60、K562、Raji細(xì)胞的IC50值結(jié)果也表明，相同濃度的DADS對(duì)K562細(xì)胞、HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)Raji細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用（P＜0.05）。

Tab 1 OD570value of different concentration DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 48 h

2．2DADS對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分率結(jié)果顯示，DADS能誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞以及Raji細(xì)胞凋亡。相同濃度DADS作用上述3種細(xì)胞，Raji凋亡細(xì)胞百分率明顯低于HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞（P＜0.05）。

Tab 2 Percentage of apoptosis cells of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 24 h．

2．3DADS對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的影響 DCFH-DA染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度結(jié)果顯示，3.0、6.0、12.0 mg·L－1DADS作用上述3種細(xì)胞8 h后，HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞的熒光強(qiáng)度呈濃度依賴性增加，但在24．0 mg·L－1DADS作用下，熒光強(qiáng)度稍有下降。相同濃度DADS作用Raji細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯低于HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞（P＜0.05）。

Tab 3 Fluorescence intensity of different concentrations of DADS treated HL-60，K562 and Raji cells for 8 h

2．4DADS對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞、Raji細(xì)胞Rac2表達(dá)的影響 RT-PCR、Western blot分析結(jié)果顯示：6．0 mg·L－1DADS作用HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞24 h后，較未處理組相比，Rac2的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.05）；而12．0 mg·L－1DADS作用Raji細(xì)胞24 h后，較未處理組相比，Rac2的表達(dá)卻明顯下調(diào)（P＜0.05）。

3　討論

本研究表明，首先，DADS作為一種有潛力的抗腫瘤藥物，不僅能抑制HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞以及Raji細(xì)胞的活性和增殖，同時(shí)能誘導(dǎo)這3種細(xì)胞凋亡，且DADS對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞的抑制增殖能力和誘導(dǎo)凋亡能力明顯強(qiáng)于Raji細(xì)胞人白血病HL-60細(xì)胞凋亡。其次，在DADS誘導(dǎo)3種細(xì)胞凋亡的過(guò)程中均有ROS的增加，NADPH氧化酶的活化是DADS誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞凋亡過(guò)程ROS的主要來(lái)源，而不是DADS誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS的主要來(lái)源。當(dāng)然，DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用效果以及具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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中國(guó)圖書分類號(hào)：R329．25；R733．7；R733．41；R916．4

關(guān)鍵詞：DADS；HL-60細(xì)胞；K562細(xì)胞；Raji細(xì)胞；Rac2；活性氧；凋亡

Key words：DADS；HL-60 cells；K562 cells；Raji cells；Rac2；ROS；apoptosis

作者簡(jiǎn)介：易 嵐（1976－），女，博士，副教授，研究方向：白血病發(fā)病及防治分子機(jī)制，Tel：0734-8281659，E-mail：yilanoky＠126．com；蘇 琦（1945－），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤發(fā)病及防治分子機(jī)制，通訊作者，Tel／Fax：0734-8281547，E-mail：suqi1＠hotmail．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81400117）；中國(guó)博士后基金（No 2014M562115）；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2015JJ4042）；南華大學(xué)歸國(guó)人員科研啟動(dòng)資金項(xiàng)目（No 2014XQD46）

收稿日期：2015－07－13，修回日期：2015－08－23

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）11－1627－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．11．030