郭列平，周　帆，石昊天，陳海敏，凌晨暉，陳小玲，侯　健,2

1.200070，上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院血液腫瘤科；2.200003上海，第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院血液科

CP節(jié)律性化療對人臍靜脈內皮細胞及其中自噬相關蛋白Beclin1、LC3的影響

郭列平1，周帆1，石昊天1，陳海敏1，凌晨暉1，陳小玲1，侯健1,2

1.200070，上海市閘北區(qū)中心醫(yī)院血液腫瘤科；2.200003上海，第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院血液科

2003年起，本課題組應用持續(xù)低劑量環(huán)磷酰胺(CTX, 50 mg/d) 聯(lián)合潑尼松(Pred, 15 mg/d) 持續(xù)口服的方案(即CP節(jié)律性化療)治療伴有嚴重并發(fā)癥的多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者[1-3]和復發(fā)/難治性MM患者[4]，均取得了明顯療效。本課題組進一步在CP方案治療前和治療后第2、4、6個月取患者骨髓組織及外周血，應用免疫組織化學法分析骨髓組織微血管密度(microvessel density, MVD)，ELISA法檢測外周血中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生長因子BB(platelet derived growth factor BB, PDGF-BB)表達水平[5]。結果發(fā)現(xiàn)，CP方案可明顯降低MM患者骨髓局部的微血管密度、血清VEGF及PDGF-BB水平，提示其對MM的治療作用可能與抑制新生血管的生成有關。

為進一步探討CP節(jié)律性化療的抗血管新生機制，筆者設計了體外試驗。由于環(huán)磷酰胺在體外無活性，需經肝臟代謝為磷酰胺氮芥(phosphoamide, PM)發(fā)揮抗腫瘤作用。故在本研究中，筆者通過建立低劑量磷酰胺氮芥聯(lián)合潑尼松龍(可等同于CP節(jié)律性化療)處理的HUVEC模型，通過CCK8法及流式細胞術檢測CP節(jié)律性化療對HUVEC增殖及凋亡的影響，之后應用Western Blot及RT-PCR等方法檢測該處理對自噬相關蛋白Beclin1及LC3等表達的調控，進而探討CP節(jié)律性化療方案抑制HUVEC生長的可能機制。

1材料與方法

1.1細胞及分組HUVEC購自中國科學院細胞庫，于37 ℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。HUVEC在實驗前2 d進行消化收集，以相同的細胞量接種至各個培養(yǎng)皿中并分別進行加藥處理，實驗分組如下：二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)對照組，磷酰胺氮芥組，潑尼松龍組，磷酰胺氮芥+潑尼松龍組(CP組)，每組重復3次。處理48 h后，收集細胞用于后續(xù)流式細胞術或是分子水平檢測。依據文獻[6，7]及結合筆者的預實驗，CP節(jié)律性化療方案中磷酰胺氮芥濃度定為5 μg/ml，潑尼松龍濃度定為50 μmol/L。

1.2HUVEC 增殖凋亡的檢測

1.2.1CCK8法檢測細胞增殖將處于對數(shù)生長期的各組的細胞株，用胰蛋白酶消化，稀釋細胞使其濃度為5×104/ml培養(yǎng)液，分別取100 μl至96孔培養(yǎng)板，每種細胞每塊板接種3個同樣的孔作為復孔，(1～5)×103/孔，以100 μl培養(yǎng)液作為空白對照，37 ℃培養(yǎng)過夜；按1∶10體積比混合Cell Counting Kit -8(CCK-8)和無血清必需基本培養(yǎng)液DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)液)，每孔100 μl加入待測孔中，37 ℃，5% CO2孵育1 h；用微板分光光度計測定450 nm波長光密度(optical density，OD值)。記錄每塊板的數(shù)值，再計算不同時間不同組藥物對HUVEC的增殖抑制率。實驗重復3次，取均值計算細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=[(DMSO對照組OD值-實驗組OD值)/DMSO對照組OD值]×100%。

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡分別取各組培養(yǎng)的HUVEC，經0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×106/L，制成單細胞懸液，加入100 μl Binding Buffer 和FITC標記的Annexin-V(20 μg/ml)10 μl，室溫避光30 min，再加入PI (50 μg/ml) 5 μl，避光反應5 min后，加入400 μl Binding Buffer，立即用FAC Scan進行流式細胞儀定量檢測其凋亡水平。

1.3Western Blot檢測細胞置于冰上，用PBS洗3次，加入蛋白裂解液及苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，冰上放置40 min，4 ℃，12 000 r/min離心40 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford法對上清進行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h，一抗4 ℃過夜。同時，另1張用不含抗體三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液(tris buffered saline and tween，TBST)孵育，作為陰性對照。反復洗膜后，將膜與堿性磷酸酶(AP)標記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后，用Western blotting印跡觀察，用圖像分析測定各帶吸光度(A)值作定量分析。

1.4RNA抽提收集10 cm培養(yǎng)皿細胞，放到1.5 ml EP管中，加入1 ml Trizol。震蕩30 s。加0.2 ml氯仿，劇烈搖動30 s，室溫3 min。12 000×g，4 ℃離心，15 min。吸上層無色水相，移入另一EP管中(約0.5 ml)。加等體積異丙醇，-20 ℃，30 min。12 000×g，4 ℃離心，10 min。在管底部可見微量RNA沉淀。棄上清，加75%乙醇1 ml，振蕩。7500×g，4 ℃離心，10 min。棄上清，用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5～10 min。沉淀溶于20 μl焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate, DEPC)水，取1 μl加入79 μl DEPC水測OD260/OD280。計算濃度與純度，-70 ℃保存。

1.5反轉錄合成cDNA及熒光定量PCR檢測自噬相關蛋白Beclin1和LC3反應體系如下：RNA 5 μl，Radome引物2 μl，RNA sin 0.5 μl，65 ℃，15 min，立即放入冰浴。RT反應體系：約2 h RNA sin 0.5 μl，10 mM dNTP 1 μl，5×RT緩沖液4 μl，25 mM MgCl24 μl，AMV反轉錄酶3 μl，混勻快速離心一次，-20 ℃冰箱凍存。按如下配方配制q-PCR反應體系：(Beclin1，LC3)上下游引物10 pmol/μl，cDNA模板2.0 μl，ddH2O 7 μl，SYBRGREEN kit，10 μl，上述反應體系置于ABI 7500熒光定量PCR儀中，采用標準反應步驟進行反應。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1CP節(jié)律性化療對HUVEC增殖的影響隨著時間的延長，PM、潑尼松龍及CP組均使HUVEC的增殖抑制率明顯提高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)。在作用HUVEC細胞24 h時，不同組的藥物對細胞的增殖抑制率也明顯不同，潑尼松龍組對細胞的抑制率最弱，而CP組對細胞的增殖抑制率最強，PM組次之，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，而作用48 h和72 h時，不同組藥物對HUVEC的增殖抑制率差異更大，差異均具有統(tǒng)計學意義(P均<0.01，表1)。

表1　CP節(jié)律性化療對HUVEC細胞的增殖抑制率　(n=3；

注：與潑尼松龍組比較，①P<0.01；與PM組比較，②P<0.01；PM為磷酰胺氮芥，CP為磷酰胺氮芥+潑尼松龍

2.2CP節(jié)律性化療對HUVEC凋亡的影響用藥處理48 h后，DMSO對照組使HUVEC凋亡率達到4.67%±0.21%，而潑尼松龍組、PM組、CP組HUVEC凋亡率依次更高，潑尼松龍使HUVEC細胞的凋亡率達到10.43%±0.50%，PM使HUVEC細胞的凋亡率達到15.60%±0.72%，二者聯(lián)用后，即CP組能使HUVEC細胞的凋亡率達到23.83%±0.80%，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001，圖1)。

圖1　CP節(jié)律性化療對HUVEC凋亡的影響

2.3自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達Western Blot和RT-PCR檢測結果均顯示，用藥處理48 h后，與DMSO對照組相比，潑尼松龍組、PM組、CP組對HUVEC細胞的Beclin1、LC3蛋白表達和mRNA表達均依次下降，提示CP組能使HUVEC自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達明顯下調，差異均具統(tǒng)計學意義(P均<0.01, 表2)。

表2　不同組藥物處理HUVEC后自噬相關蛋白Beclin1和LC3蛋白及mRNA表達情況　(n=3；

注：與DMSO對照組比較，①P<0.01；與潑尼松龍組比較，②P<0.01；與PM組比較，③P<0.01；PM為磷酰胺氮芥，CP為磷酰胺氮芥+潑尼松龍

3討論

MM是一種起源于漿細胞的惡性克隆性疾病，常合并有骨質破壞、腎功能不全、高鈣血癥、感染、造血功能損害、高黏滯綜合征、淀粉樣變，以及神經系統(tǒng)損害等。由于這些并發(fā)癥的存在，患者一般狀況較差，加之患者多為老年人，常合并其他疾病，這些因素都限制了細胞毒化療藥物在MM治療上的應用。

目前，節(jié)律性化療在實體腫瘤方面已經取得了顯著的療效[8-14]。環(huán)磷酰胺聯(lián)合潑尼松節(jié)律性化療對淋巴瘤的生長有較強的抑制作用[15]，對MM也有很好的治療作用[16-18]，但是其分子機制仍然不明。本研究結果表明，CP節(jié)律性化療能使HUVEC增殖大幅度降低，加速了HUVEC的凋亡，支持了筆者前期研究結果CP節(jié)律性化療可以抑制血管內皮細胞的增殖，對MM的治療具有重要意義。

自體吞噬(簡稱自噬)是細胞自身降解陳舊蛋白、細胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以實現(xiàn)自身代謝需要和某些細胞器更新的過程。在營養(yǎng)缺乏等特殊環(huán)境下，自噬可以通過與凋亡不同的降解機制(膜包被降解)和分子機制(特定基因的激活)，使細胞程序性死亡。在腫瘤發(fā)展的早期，自噬現(xiàn)象能夠抑制腫瘤的形成，如果此時阻礙自噬，將會促使癌前病變的發(fā)生[19]。自噬通過調節(jié)細胞內過氧化物濃度，改變體內蛋白代謝紊亂狀態(tài)，保持細胞內環(huán)境穩(wěn)定，抑制腫瘤的形成[20]。而Beclin1是調控自噬的重要基因。自噬基因Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因。人類Beclin1基因位于染色體17q21上，是一個雙等位腫瘤抑制基因。Beclin1缺陷明顯增加肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌的發(fā)生率[21]。LC3是酵母ATG8基因在哺乳動物中的同源物，定位在自噬體膜上，參與自噬體的形成，特異地反應細胞內自噬體的數(shù)量，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標記蛋白[22]。通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)CP節(jié)律性化療能顯著降低HUVEC細胞自噬相關蛋白Beclin1和LC3蛋白和mRNA的表達水平，提示其對血管內皮的抑制作用中有自噬相關蛋白的參與。

VEGF在骨髓瘤細胞表達顯著升高，當其被干擾后，骨髓瘤細胞U266的增殖能力、遷移能力受到顯著的抑制[23]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，CP節(jié)律性化療可明顯降低MM患者骨髓局部的微血管密度，血清VEGF及PDGF-BB水平[5]。但Beclin1與VEGF的作用關系目前研究較少。文獻[24]報道，在宮頸癌細胞系CaSki cells中pcDNA3.1-Beclin1過表達，而VEGF的蛋白水平顯著降低，并且導致腫瘤細胞的遷移水平升高。另有文獻[25]報道，貝伐單抗治療也上調自噬相關基因Beclin1和LC3的表達，并增加自噬體的形成。但抑制自噬能增加活性氧(ROS)的生成，并明顯增加肝癌細胞系HCC細胞在低營養(yǎng)和低氧環(huán)境下的凋亡水平。而聯(lián)合自噬抑制劑和貝伐單抗較單用更能抑制HCC異種移植物的腫瘤生長，提示自噬抑制藥可能是增加抗血管新生制劑有效性的一種新的方法。本研究發(fā)現(xiàn)，CP節(jié)律性化療能使HUVEC細胞Beclin1和LC3的表達水平顯著降低，但HUVEC凋亡明顯增高，提示CP節(jié)律性化療不僅抑制血管新生，還可抑制自噬。筆者推測，CP節(jié)律性化療在調控Beclin-1和VEGF的同時，還可能影響ROS的生成，從而影響血管新生(有待于實驗進一步證實)。因此，自噬的下調可以提高HUVEC對CP節(jié)律性化療的敏感性。

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(2014-11-25收稿2014-12-29修回)

(責任編輯武建虎)

【摘要】目的研究持續(xù)低劑量磷酰胺氮芥(phosphoamide, PM)聯(lián)合潑尼松龍(CP節(jié)律性化療方案)對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)自噬相關蛋白Beclin1和LC3表達水平的影響，探討節(jié)律性化療增加HUVEC對化療藥物敏感性的機制。方法實驗分DMSO對照組、磷酰胺氮芥(PM)組、潑尼松龍組、磷酰胺氮芥+潑尼松龍組(CP組)，每組重復3次。采用不同的藥物處理HUVEC，用CCK8法檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，免疫印跡法和反轉錄PCR檢測自噬相關蛋白的表達水平。結果(1)與DMSO對照組相比，隨著時間的延長，PM、潑尼松龍及CP組均使HUVEC的增殖抑制率明顯升高(P均<0.001)，并且在相同作用時間，不同組的藥物對細胞的增殖抑制率也明顯不同，潑尼松龍組對細胞的抑制率最低，而CP組對細胞的增殖抑制率(72 h，25.1%±0. 7%)最高，PM組(72 h，20.4%±0.7%)次之(P均<0.01)；(2)用藥處理48 h后，與DMSO對照組相比，潑尼松龍組、PM組、CP組使HUVEC細胞的凋亡率依次增高(P均<0.001)；(3)用藥處理48 h后，與DMSO對照組相比，潑尼松龍組、PM組、CP組的Beclin1、LC3的蛋白表達和mRNA表達水平均依次下降(P均<0.001)。結論人臍靜脈內皮細胞HUVEC經CP節(jié)律性化療方案處理后，可以顯著降低HUVEC細胞的增殖水平，促進HUVEC細胞的凋亡，并顯著降低自噬相關蛋白Beclin1和LC3的表達水平。

【關鍵詞】節(jié)律性化療；自噬相關蛋白；Beclin 1；LC3

【中國圖書分類號】R733

Effect of CP metronomic chemotherapy on HUVEC cells and autophagy-related protein Beclin1 and LC3

GUO Lieping1, ZHOU Fan1, SHI Haotian1, CHEN Haimin1, LIN Chenhui1, CHEN Xiaoling1, and HOU Jian1, 2.1. Department of Hematology and Oncology, Shanghai Zhabei District Central Hospital, Shanghai200070, China; 2. Department of Hematology, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of CP metronomic chemotherapy on HUVEC cells and autophagy-related protein, Beclin1 and LC3, expression levels, and to explore the mechanism of CP program increasing sensitivity of HUVEC cells to chemotherapeutic drug. MethodsSubjects were divided into the DMSO control group, and the phosphoramide mustard (PM) group, the prednisolone group, the phosphoramide mustard and prednisolone group (the CP group). HUVEC cells were treated with different drugs. CCK8 method was used to detect cell proliferation, flow cytometry to detect the cell apoptosis, Western blot and RT-PCR to detect autophagy-related protein levels. ResultsCCK8 method showed that compared with DMSO control group, in the PM, the prednisolone and the CP groups, HUVEC cell proliferation inhibition rates increased significantly with the extension of time (P<0.001). And at the same time, the different drug groups were significantly different in cell proliferation inhibition rate, the prednisone group was the weakest, the CP group(72 h，25.1%±0. 7%)was the strongest, and the PM group (72 h，20.4%±0.7%) was intermediate(P<0.01). Flow cytometry showed that after 48 hours, compared with the DMSO control group, the prednisolone, the PM and the CP groups made HUVEC cell apoptosis rate increased in turn (P<0.001). Western blot and reverse transcription PCR showed that after 48 hours, compared with the DMSO control group, Beclin1 and LC3 protein and mRNA expression decreased in turn in the prednisolone group, the PM group and the CP group(P<0.001). ConclusionsHUVEC cells treated with CP metronomic chemotherapy can significantly reduce the level of HUVEC cell proliferation, promote HUVEC cell apoptosis, and significantly reduce autophagy-related protein expression levels of Beclin1 and LC3.

【Key words】metronomic chemotherapy；autophagy-related protein；Beclin 1; LC3

通訊作者：侯健，E-mail：houjian167@sohu.com

作者簡介：郭列平，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：glplaying2000@163.com