胃癌患者細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶5蛋白的檢測(cè)意義

曾靜, 張俊

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院 體檢中心, 湖北 十堰, 442000)

關(guān)鍵詞:胃癌; 細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶5; 檢測(cè)

胃癌是消化道的一種常見(jiàn)惡性腫瘤，對(duì)人類(lèi)的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[1]。1992年細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶 5(Cdk5)被鑒定，定位于染色體7號(hào)長(zhǎng)臂第3區(qū)第6帶(7q36)上，其能在全身不同組織細(xì)胞內(nèi)分布[2]。本研究通過(guò)免疫組化染色等方法探討胃癌中Cdk5蛋白的表達(dá)及意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

分析2010年5月—2014年5月在本院接受手術(shù)治療的胃癌患者的胃癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本(包埋于石蠟中)。病例需全部接受病理的確診。術(shù)前病例均無(wú)任何放化療史，對(duì)所有患者實(shí)施D2胃癌根治術(shù)。隨訪全組患者，隨訪時(shí)間為3～76個(gè)月。由經(jīng)驗(yàn)豐富的2位病理醫(yī)師復(fù)查所有入選對(duì)象的HE切片，確保病理診斷的準(zhǔn)確性。

1.2　研究方法

免疫染色二步法: ① 將包埋于石蠟中胃癌組織切片(4 μm)后烘干; ② 使用梯度松節(jié)油和酒精對(duì)切片進(jìn)行脫蠟，然后用蒸餾水和PBS液水化切片; ③ 對(duì)切片實(shí)施高壓法達(dá)到將抗原修復(fù)的目的; ④ 孵育后PBS液沖洗; ⑤ 滴加一抗，即兔抗人Cdk5多克隆1∶500); ⑥ 滴加試劑MT-CelLytics，滴加試劑RIPA(細(xì)胞裂解液); ⑦ 使用DAB溶液進(jìn)行顯色反應(yīng); ⑧ 采用蘇木素對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染; ⑨ 將切片脫水后使用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片處理; ⑩ 構(gòu)建空白對(duì)照，用PBS液代替步驟⑤中的一抗，其他均相同。

一抗用PBS代替作陰性對(duì)照，組織呈陽(yáng)性作陽(yáng)性對(duì)照。隨機(jī)從每片中抽取高倍視野(×400) 5個(gè)，計(jì)算細(xì)胞陽(yáng)性率。判斷染色結(jié)果：參照腫瘤著色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性率記分。著色強(qiáng)度：≥4分，高表達(dá); 1～3分，低表達(dá); 0分，無(wú)表達(dá)。細(xì)胞陽(yáng)性率: >51%, 3分; 26%～50%，2分; 6%～25%，1分；≤5%，0分。

提取胃癌組織蛋白: ① 在勻漿器內(nèi)將胃癌組織與MT-CelLytics、Mammalian Protease Inhibitor Cocktail勻漿; ② 離心勻漿液; ③ 提取上清液存于冰箱內(nèi)備用。

蛋白定量(BAC法): ① 配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)液; ② 配制BAC工作液; ③ 在96孔板中加適量標(biāo)準(zhǔn)品于標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)，樣品孔內(nèi)加入體積樣品; ④ 將BAC工作液加入各孔內(nèi); ⑤ 通過(guò)測(cè)量波長(zhǎng)、A562以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

免疫印跡法(檢測(cè)Cdk5蛋白在新鮮胃癌組織中的表達(dá)量): ① 變性蛋白樣品與緩沖液的混合液后制膠; ② 在泳道內(nèi)滴加預(yù)染蛋白marker及樣品; ③ 電泳后電轉(zhuǎn)膜; ④ 使用硝酸纖維素膜進(jìn)行染色反應(yīng); ⑤ 將免疫反應(yīng)非特異性的結(jié)合位點(diǎn)封閉后加一抗，孵育; ⑥ 回收一抗后滴加二抗; ⑦ 取ECL發(fā)光試劑適量進(jìn)行發(fā)光反應(yīng); ⑧ 掃描、曝光; ⑨ 和密度半定量分析。比較胃癌組織與癌旁組織、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的Cdk5表達(dá)差異，并探討Cdk5表達(dá)與胃癌組織的病理特征間的相關(guān)性。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)計(jì)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用卡方(χ2)檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　一般資料

本研究共納入胃癌患者103例，包括胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本各103個(gè)。入組的患者臨床資料見(jiàn)表1。

表1　患者臨床資料

2.2　胃癌與癌旁組織、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的Cdk5表達(dá)比較

胃癌與癌旁組織、原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的Cdk5陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)弱見(jiàn)表2, 可見(jiàn)胃癌組織的Cdk5強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁組織(χ2=18.26,P<0.01)。

表2　胃癌與癌旁組織、原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的Cdk5表達(dá)比較

2.3　Cdk5表達(dá)與胃癌組織的病理特征相關(guān)性

不同病理特征包括組織學(xué)分型、腫瘤直徑、腫瘤部位、Borrmann分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的胃癌組織所對(duì)應(yīng)的Cdk5表達(dá)情況見(jiàn)表3，結(jié)果提示胃癌組織的Cdk5的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌組織的組織學(xué)分型(χ2=11.59,P<0.01)、Borrmann分型(χ2=10.53,P<0.01)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(χ2=14.62,P<0.01)均有顯著相關(guān)性。

表3　Cdk5表達(dá)與胃癌組織的病理特征相關(guān)性

3討論

目前中國(guó)胃癌的死亡率在逐年上升，對(duì)中國(guó)人的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，給家庭和社會(huì)都造成了沉重的負(fù)擔(dān)，是常見(jiàn)的一種惡性腫瘤[3]。Cdk5是周期依賴(lài)性蛋白酶一族中的特殊成員，其不直接對(duì)細(xì)胞周期(哺乳動(dòng)物)進(jìn)行調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白也不能將Cdk5激活[4]。Cdk5可以在大腦發(fā)育期間調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的死亡和生存信號(hào)、遷移、軸突和分化的延伸、激活和形成突觸以及骨架成分等，參與多種疾病的發(fā)病過(guò)程，跟各種腫瘤的形成都有著密切的關(guān)系[5]。

本研究實(shí)施免疫組化染色SP法，結(jié)果顯示在胃癌組織內(nèi)，Cdk5表達(dá)的弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性率與癌旁組織相比較，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將患者病理學(xué)參數(shù)和Cdk5的表達(dá)程度結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，Cdk5的表達(dá)程度和胃癌的Borrmann分型、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分型的關(guān)系都很密切，因此作者可以推測(cè)Cdk5蛋白與胃癌的發(fā)生可能有關(guān)聯(lián)，呈現(xiàn)出的低表達(dá)率也許對(duì)胃癌的發(fā)病過(guò)程起著一定的促進(jìn)作用[6]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Cdk5 蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織內(nèi)的陽(yáng)性率比原發(fā)胃癌組織中明顯低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。將患者病理學(xué)參數(shù)和Cdk5的表達(dá)程度結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，Cdk5的表達(dá)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移量以

及腫瘤浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，腫瘤浸潤(rùn)深度隨著Cdk5表達(dá)的降低而加深，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移量隨著Cdk5表達(dá)的降低而增加，故作者推測(cè)Cdk5對(duì)抑制蛋白的轉(zhuǎn)移起著一定的作用，胃癌病程中，癌細(xì)胞使自身Cdk5蛋白的水平下降，從而達(dá)到促進(jìn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的目的[8]。

還有研究[9]指出Cdk5表達(dá)是對(duì)胃癌患者預(yù)后評(píng)估的一個(gè)獨(dú)立因素，患者的5年存活率是隨著Cdk5在癌組織內(nèi)表達(dá)的上升而上升。在胃癌的診療方面，Cdk5蛋白有望成為靶點(diǎn)。總之，本研究結(jié)果顯示，相對(duì)癌旁組織，Cdk5在胃癌組織內(nèi)為明顯低表達(dá)；而相對(duì)原發(fā)的胃癌組織，Cdk5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中為明顯低表達(dá)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cdk5的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型、淋巴結(jié)是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及Borrmann分型密切相關(guān)[10]。

參考文獻(xiàn)

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基金項(xiàng)目:湖北省十堰市科技局科研項(xiàng)目(EK2013D150001000079)

收稿日期:2014-12-20

中圖分類(lèi)號(hào):R 735.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)09-153-02

DOI:10.7619/jcmp.201509051