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電針對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠藍(lán)斑nNOS表達(dá)的影響**

謝康楠1唐國(guó)慶1詹海斌1楊凱1趙健2

皖南醫(yī)學(xué)院1臨床醫(yī)學(xué)院2011級(jí)2人體解剖學(xué)教研室，安徽省蕪湖市241002

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Posttraumatic stress disorder, PTSD)，指對(duì)親身經(jīng)歷、目擊的導(dǎo)致或可能導(dǎo)致自己、他人死亡或嚴(yán)重軀體傷害的意外事件、嚴(yán)重創(chuàng)傷的強(qiáng)烈反應(yīng)，主要由交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)(SAS)的快速激活和下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA axis)的興奮激活來(lái)激發(fā)。一氧化氮(Nitricoxide, NO)在生物體各組織中都有廣泛的分布，特別是在神經(jīng)組織中。研究表明針灸有助于治療PTSD患者[1，2]，邁克爾·霍利菲爾德博士及其同事對(duì)73位被診斷為PTSD患者進(jìn)行分組治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中醫(yī)傳統(tǒng)的針灸治療效果與認(rèn)知行為治療相似[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者采用穴位刺激調(diào)控結(jié)合藥物[4]、不同針灸方法結(jié)合[5]、認(rèn)知行為療法配合穴位刺激調(diào)控法[6，7]及藥物治療配合高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)[8]等方法治療PTSD患者，均取得了肯定的臨床療效。上述研究多集中在電針對(duì)PTSD的臨床療效方面，而電針對(duì)PTSD治療的機(jī)制研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)主要觀察低頻電針對(duì)PTSD模型大鼠藍(lán)斑內(nèi)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neural nitric oxide synthase,nNOS)表達(dá)的影響，探討電針治療PTSD的可能機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用電針治療PTSD提供一些基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組與模型建立成年雄性SD大鼠30只，體重200~250g。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨即分為三組：正常對(duì)照組、模型組和電針組。模型組采用單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激(Single prolonged stress,SPS)方法，步驟如下：禁錮2h；強(qiáng)迫性游水20min后干燥毛發(fā)，休息15min；乙醚麻醉。無(wú)干擾空間、常規(guī)喂養(yǎng)1周后對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)(曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、拒俘反射、恐懼記憶)，以確定模型成功。電針組在模型建立后給予低頻(2Hz)電針刺激“百會(huì)”與“足三里”穴，強(qiáng)度3V，波寬1ms，持續(xù)30min，連續(xù)1周。對(duì)照組不予以任何刺激和電針治療。

1.2實(shí)驗(yàn)方法上述實(shí)驗(yàn)步驟完成后，三組大鼠給予戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔麻醉，經(jīng)左心室灌注固定，取腦放置于4℃的4%甲醛固定，脫水、透明、浸蠟、包埋。連續(xù)組織切片，片厚5μm，常規(guī)脫蠟至水，SABC法進(jìn)行免疫組化染色：3%H2O2孵育5~10min，微波抗原修復(fù)(高溫3min，低溫12min)，自然冷卻后滴加5%BSA封閉液室溫孵育20min，滴加一抗4℃過(guò)夜。次日于常溫滴加生物素化二抗37℃水浴2h，滴加SABC 37℃水浴30min，DAB顯色，鏡下控制顯色時(shí)間。最后脫水、透明、封片。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用Olympus顯微鏡及成像系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組大鼠藍(lán)斑(圖1)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)并測(cè)量平均灰度值，每組10只大鼠共測(cè)20個(gè)單位面積的灰度值(其中每只隨機(jī)測(cè)2個(gè)單位面積)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1　大鼠藍(lán)斑區(qū)定位

注：免疫組化染色，×40，冠狀切面前面觀，黑色方框內(nèi)為鏡下檢測(cè)部位。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)結(jié)果觀察模型組大鼠5min穿行格數(shù)和直立次數(shù)顯著低于正常對(duì)照組(P<0.01)，電針組大鼠5min穿行格數(shù)和直立次數(shù)較模型組有所增加(P<0.01)，但仍低于正常對(duì)照組。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果(±s，n=10)

表1　各組大鼠行為學(xué)觀察結(jié)果(±s，n=10)

行為正常對(duì)照組模型組電針組穿格數(shù)97.4±11.3950.9±7.59*72.6±14.95#直立數(shù)14.4±2.559.7±2.26*14.1±3.03#

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

2.2免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察正常對(duì)照組大鼠藍(lán)斑區(qū)有少量nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)，胞漿著色，胞核呈空泡狀。模型組大鼠藍(lán)斑nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.01)，細(xì)胞染色加深，細(xì)胞平均灰度值明顯降低(P<0.01)。電針組大鼠藍(lán)斑區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)較模型組明顯減少，細(xì)胞染色變淡，平均灰度值有所升高(P<0.01)。 見(jiàn)圖2、3。

正常對(duì)照組　　　　　　　　　　　　　　　　模型組　　　　　　　　　　　　　　　電針組

3討論

以往的研究表明，通過(guò)單一應(yīng)激因子制作PTSD動(dòng)物模型往往很難產(chǎn)生理想的效應(yīng)。由Porsolt[9]等最先設(shè)計(jì)了強(qiáng)迫游泳，用來(lái)模擬自然情況下在水中的創(chuàng)傷經(jīng)歷，大鼠會(huì)產(chǎn)生溺水的恐怖感，從發(fā)生上接近PTSD的致病病因。隨后Liberzon[10]等進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)展了單一長(zhǎng)時(shí)程應(yīng)激，增加心理應(yīng)激(束縛)、生理應(yīng)激(強(qiáng)迫游泳20min后，再以乙醚麻醉致意識(shí)喪失)，模擬了大鼠在自然環(huán)境中有可能遭遇到的應(yīng)激類型，再給予大鼠應(yīng)激后采用不受打擾的飼養(yǎng)方式，這樣較好的避免了環(huán)境因素對(duì)模型的影響，確保模型的穩(wěn)定性，并能誘發(fā)動(dòng)物表現(xiàn)出PTSD的臨床癥狀和神經(jīng)內(nèi)分泌改變[11]，隨后在2005年日本文部省召開(kāi)的國(guó)際PTSD科學(xué)會(huì)議上，SPS法被確定為公認(rèn)的PTSD動(dòng)物模型制作方法[12]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了SPS法能使大鼠在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)的應(yīng)激下理想地顯示長(zhǎng)期的行為學(xué)改變。SPS刺激后的大鼠經(jīng)過(guò)7~14d靜養(yǎng)，在活動(dòng)習(xí)性上有明顯改變，焦慮情緒以及恐懼記憶增強(qiáng)，學(xué)習(xí)能力受損，與PTSD患者臨床癥狀需要幾個(gè)月的孕育期，其癥狀開(kāi)始明朗的特點(diǎn)相似，其表現(xiàn)符合PTSD患者主要的臨床表現(xiàn)。

圖3　各組大鼠藍(lán)斑區(qū)nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

根據(jù)NOS的性質(zhì)結(jié)構(gòu)及其對(duì)鈣的依賴性不同，可分為二大類，即Ca2+依賴性的結(jié)構(gòu)型NOS和非Ca2+依賴性的誘導(dǎo)型NOS，前者又根據(jù)存在的部位和分子的大小不同分為nNOS和內(nèi)皮型NOS，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要是nNOS。nNOS在神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)與行為調(diào)控、突觸可塑性與神經(jīng)再生、神經(jīng)傳導(dǎo)與神經(jīng)元發(fā)育等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理功能中起重要的調(diào)節(jié)作用[13]。侯良芹[14]等研究發(fā)現(xiàn)，PTSD模型大鼠海馬nNOS表達(dá)增強(qiáng)，電針可恢復(fù)性下調(diào)其表達(dá)。PTSD模型大鼠海馬內(nèi)高表達(dá)的NO可能參與了海馬神經(jīng)元損傷、凋亡導(dǎo)致體積縮小的病理過(guò)程。

藍(lán)斑位于腦橋背側(cè)第四腦室底的界溝上部深面，纖維聯(lián)系較為廣泛，其內(nèi)富含大量的去甲腎上腺(NE)能神經(jīng)元，并在應(yīng)激狀態(tài)下被迅速激活，使NE合成增多，從而適應(yīng)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的變化。李慢[15]對(duì)發(fā)生PTSD的退伍軍人進(jìn)行尸體解剖發(fā)現(xiàn)，藍(lán)斑神經(jīng)元數(shù)目減少，并存在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。由此可見(jiàn)藍(lán)斑的功能變化在PTSD的發(fā)生中有重要作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到PTSD模型大鼠藍(lán)斑內(nèi)nNOS的表達(dá)增強(qiáng)，這與海馬區(qū)的現(xiàn)象一致，進(jìn)一步提示NO在應(yīng)激引起的神經(jīng)元損傷、凋亡等病理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

百會(huì)位居巔頂，歸屬督脈，督脈“入絡(luò)腦”，本著“經(jīng)脈所過(guò)，主治所及”，其對(duì)于與腦有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有治療作用。朱寅初等[16]研究顯示，電針百會(huì)、足三里穴對(duì)模型動(dòng)物記憶力的下降有改善作用。所以，選取督脈腧穴是治療精神神經(jīng)疾病的重要方法。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針組大鼠藍(lán)斑內(nèi)nNOS表達(dá)較模型組有所減弱，提示電針能下調(diào)PTSD模型大鼠nNOS的過(guò)高表達(dá)，其機(jī)制可能與電針能顯著降低應(yīng)激大鼠異常升高的藍(lán)斑NO含量和NOS活性，從而防止藍(lán)斑神經(jīng)細(xì)胞丟失有關(guān)，確切機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

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摘要目的：觀察電針對(duì)創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)模型大鼠行為學(xué)的影響，并進(jìn)一步研究電針對(duì)PTSD模型大鼠藍(lán)斑核神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)的影響。方法：將雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組、模型組和電針組，每組10只。采用單程長(zhǎng)時(shí)應(yīng)激(SPS)方法建立PTSD模型，模型建立后電針大鼠“百會(huì)”穴和“足三里”穴，頻率2Hz，強(qiáng)度3V，持續(xù)30min，連續(xù)1周。采用免疫組織化學(xué)方法觀察nNOS在大鼠藍(lán)斑的表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠藍(lán)斑nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)，平均灰度值顯著降低(P<0.01)；電針后大鼠藍(lán)斑nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，平均灰度值顯著增加(P<0.01)。 結(jié)論：電針可下調(diào)PTSD模型大鼠藍(lán)斑nNOS的表達(dá)，推測(cè)這可能是電針治療PTSD機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞PTSD藍(lán)斑神經(jīng)元型一氧化氮合酶電針大鼠

Effect of Electroacupuncture on Locus nNOS Expression in Rats of Post-traumatic Stress Disorder Model

XIE Kangnan#，TANG Guoqing，ZHAN Haibin，etal.#DepartmentofClinicalMedicine,Classof2011,WannanMedicalCollege,WuhuCity,AnhuiProvince241002

ABSTRACTObjective:To observe the electrical behavior of rats to learn the impact of post-traumatic stress disorder(PTSD),and further study the expression for the electric rat model of PTSD locus coeruleus neuronal nitric oxide synthase (nNOS) impact.Methods:30 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups: normal control group, model group and electroacupuncture(EA) groups of 10. Using one-way long stress (SPS) method to establish PTSD model after model“Baihui”Point EA rats and“Zusanli”Point, frequency 2Hz,strength 3V,sustained 30min,for a week.Immunohistochemistry was used to observe the expression of nNOS in rat locus coeruleus.Results:Compared with the normal control group,model group locus coeruleus nNOS positive cells was significantly increased (P<0.01),significantly reduce the average gray value(P<0.01);rat locus coeruleus nNOS positive cells was significantly reduced after EA (P<0.01),a significant increase in the mean gray value (P<0.01).Conclusion:EA can down regulate the expression of nNOS locus coeruleus PTSD rat model,suggesting that this may be one mechanism of acupuncture treatment of PTSD.

KEY WORDSPTSD,Locus coeruleus,Neuronal nitric oxide synthase,EA,Rat

收稿日期2015-05-15

中圖分類號(hào)：R-33

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)18-2421-03

基金項(xiàng)目：安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(AH201310368127)。通訊作者：趙健