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β>3腎上腺素能受體基因多態(tài)性與冠心病發(fā)病相關(guān)性的研究

劉永生1,韓洪波2,趙佳輝1

(1.解放軍第208醫(yī)院 心內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130062；2.解放軍第208醫(yī)院 內(nèi)分泌科)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)是由于冠狀動(dòng)脈器質(zhì)性和/或功能性病變引發(fā)的冠狀動(dòng)脈供血與心肌耗氧量間的供需矛盾而導(dǎo)致的心肌缺氧損害。本病系病死率極高的疾病之一，已被公認(rèn)為是人類健康的殺手?？梢?jiàn)如何對(duì)冠心病做到早診斷、早治療、早預(yù)防是我們目前需要攻克的醫(yī)學(xué)難關(guān)。但目前冠心病的病因并未被完全闡明，其病因復(fù)雜，是先天遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)與后天飲食、代謝、運(yùn)動(dòng)等生活習(xí)慣因素長(zhǎng)期相互做用而引發(fā)的這一觀點(diǎn)已得到公認(rèn)。在后天生活習(xí)慣等因素在防治冠心病被強(qiáng)調(diào)的同時(shí)，人們同樣渴望在基因水平探討出冠心病的發(fā)病相關(guān)因素。一些與脂代謝密切相關(guān)的基因已經(jīng)成為本病的候選基因而被作為針對(duì)本病病因的研究熱點(diǎn)。腎上腺素能受體在冠心病的病因研究中一直占較重位置，繼β1-AR與心肌耗氧量及β2-AR與血管損傷被廣泛研究后，β3-AR已被重視并深入研究，曾有研究表明β3-AR可以介導(dǎo)脂肪代謝相關(guān)反應(yīng)，使之分解生熱[1]，也有學(xué)者稱此受體基因變異能夠?qū)е轮x異常及肥胖，而如上兩條均為冠心病發(fā)病的高危因素，鑒于此，β3-AR基因進(jìn)入了冠心病發(fā)病的重要候選基因群。對(duì)于β3-AR基因的多態(tài)性研究較多的是此基因第一外顯子的第190位點(diǎn)多態(tài)性，此基因位點(diǎn)野生型的T可以突變?yōu)镃，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這一位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了一系列研究，從所得數(shù)據(jù)分析此位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病的發(fā)病及病情輕重的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象冠心病組：選自于解放軍208醫(yī)院就診的患者，就診時(shí)段為2009年2月-2014年5月，入選患者均經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診的冠心病患者131人，其中男性69人，女性62人，年齡為50.12±6.95。健康中老年人組系同期于解放軍208醫(yī)院門診體檢或住院的中老年人，經(jīng)320排CT或冠狀動(dòng)脈造影檢查排除冠心病，經(jīng)隨機(jī)選取所得實(shí)驗(yàn)對(duì)象共計(jì)125人，其中男性66人，女性59人，年齡為52.13±7.54。以上兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象年齡及性別比例均經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示組間呈現(xiàn)匹配關(guān)系。冠心病患者131人按冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果行SYNTAX評(píng)分[2]分為3組，分組相關(guān)詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1　冠心病組按SYNTAX評(píng)分分組情況

以上3組實(shí)驗(yàn)對(duì)象的性別比例、年齡經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)顯示各組間呈現(xiàn)匹配關(guān)系。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象血常規(guī)、肝功能及腎功能均正常，需排除肝、腎疾病。糖尿病患者為本實(shí)驗(yàn)排除對(duì)象。所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象均為漢族，且各實(shí)驗(yàn)對(duì)象間無(wú)血緣關(guān)系。

1．2制備模板DNA 實(shí)驗(yàn)對(duì)象均晨起時(shí)采集空腹靜脈血4 ml，抗凝劑用EDTA-K2，參照文獻(xiàn)中所講的碘化鈉裂解、戊醇及氯仿提取法[3]經(jīng)白細(xì)胞提取基因組DNA，所提取DNA-30℃保存。

1．3引物合成引物設(shè)計(jì)均參照文獻(xiàn)[4]，針對(duì)β3-AR基因第一外顯子的一個(gè)片段，此片段中包含第190位點(diǎn)及其上下游的相關(guān)DNA序列。(兩引物均由上海生工生物工程有限公司合成)上游引物為：5′-CGCCCAATACCGCCAACA-3′下游引物為：5′-CCACCAGGA GTCCCATCACC-3′。

1．4擴(kuò)增條件及反應(yīng)體系本實(shí)驗(yàn)PCR體系25 μl ，體系含DNA模板100 ng，2.5 μl 10×PCR緩沖液，Taq酶2.5 U (上海生工生物工程有限公司生產(chǎn))，15 mmol/L dNTPs 0.5 μl ，引物上、下游各2 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性96℃5 min，此后95℃、55℃、72℃各40 S，循環(huán)30次，延伸溫度72℃，時(shí)間10 min，保存溫度為4℃。所用PCR儀為Primus25型。

1．5限制性酶切條件取5 μl前述實(shí)驗(yàn)所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在37℃下用BstNI 10U酶切作用7 h。反應(yīng)完成后，如上酶切產(chǎn)物在120 V 電壓下于3%瓊脂糖凝膠電泳6 h，電泳后EB染色，此后以長(zhǎng)度DL100DNA為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行參照分析，結(jié)果需在紫外燈下判斷，拍照留存。

1．6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用組間直接對(duì)比分析法，計(jì)算各基因型及等位基因頻率在人群中所占百分比，不同組間等位基因頻率對(duì)比用χ2檢驗(yàn)，所用軟件包為SPSS13.0。組間具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2結(jié)果

2．1β3-AR基因第一外顯子190位點(diǎn)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為210 bp，此擴(kuò)增產(chǎn)物包含待測(cè)位點(diǎn)及其上下游的一段DNA序列，此位點(diǎn)T/C突變發(fā)生后可使原有的一個(gè)BstNI限制性酶切位點(diǎn)消失，據(jù)此以BstNI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物后分析?；蛐凸灿?種：正常純合子TT型可得酶切產(chǎn)物為5條帶(99、62、30、12、7 bp)，突變雜合子TC型為6條帶(161、99、62、30、12、7 bp)，突變純合子CC為4條帶(161、30、12、7 bp)，本基因型的判斷主要通過(guò)讀取99及161 bp兩個(gè)條帶來(lái)完成。

2．2冠心病組及對(duì)照組兩組人群待測(cè)位點(diǎn)T/C多態(tài)性比較分析此位點(diǎn)多態(tài)性分布在如上兩組人群中的分布頻率有顯著性差異(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2　冠心病組與對(duì)照組β3-AR基因第一外顯子190位點(diǎn)T/C頻率分布〔n(%)〕

冠心病組與健康中老年組對(duì)比顯示組間基因型分布存在明顯差異P<0.05

2．3SYNTAX評(píng)分各組人群待測(cè)位點(diǎn)T/C多態(tài)性比較分析冠心病3個(gè)亞組間此位點(diǎn)多態(tài)性分布無(wú)顯著性差異(P>0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3　SYNTAX評(píng)分各組β3-AR基因第一外顯子190位點(diǎn)T/C頻率分布〔n(%)〕

如上三組間待測(cè)位點(diǎn)多態(tài)性分布頻率差異無(wú)顯著性P>0.05

3討論

冠心病近年來(lái)發(fā)病呈現(xiàn)明顯上長(zhǎng)趨勢(shì)。2008年世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示心血管病患者約占全年總死亡人數(shù)的1/4。目前以細(xì)菌培養(yǎng)加藥敏為指導(dǎo)的抗生素正規(guī)使用及以多維超聲在產(chǎn)前檢查中應(yīng)用的日益廣泛，就病因?qū)⑿难芗膊》诸惖慕M成比例也隨之明顯改變，也就是原來(lái)在心血管病組成中占主要比例的風(fēng)濕性心臟病和先天性心臟病的比例明顯減低，而冠心病隨著全社會(huì)的人口老齡化在心血管病中的比率大為提高。在我國(guó)有統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示冠心病在男性發(fā)病率比過(guò)去增加26.10%，在女性為19.00%。對(duì)中老年人群而言，冠心病是一種常見(jiàn)而后果嚴(yán)重的疾病，從基因角度將其病因進(jìn)一步闡明一直是眾多心血管科醫(yī)務(wù)工作者的渴望。許多醫(yī)務(wù)工作者堅(jiān)定的認(rèn)為冠心病是一種與多基因相關(guān)的疾病，如果這一疾病的基因水平發(fā)病相關(guān)因素得以一一闡明，那么對(duì)這一疾病的防、診、治能力將隨之有極大的提高。

β3-AR是眾多跨膜受體中的一種，是G蛋白偶聯(lián)受體，這種受體在人類的棕色及白色脂肪中均有分布。除此之外，心臟、消化道、骨骼肌等部位也有這種受體分布，但含量相對(duì)脂肪組織較少。β3-AR具有促進(jìn)白色脂肪分解及棕色脂肪產(chǎn)熱的作用，是人體基礎(chǔ)代謝率和脂肪代謝的重要調(diào)節(jié)因子。已有臨床研究證明冠心病患者的血膽固醇、低密度脂蛋及甘油三酯水平均明顯高于無(wú)冠心病者。血脂異常者更易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，且血脂異常的嚴(yán)重程度與血管病變的程度及彌漫程度正向相關(guān)[5]。有血脂異常的冠心病患者經(jīng)正規(guī)的他汀類藥物治療，其冠心病程度的進(jìn)展會(huì)得到一定程度的控制[6]。鑒于如上分析，β3-AR基因就成了研究冠心病發(fā)病相關(guān)因素的重要候選基因之一，針對(duì)這一基因各多態(tài)性位點(diǎn)的研究將會(huì)對(duì)冠心病基因水平的發(fā)病相關(guān)因素的闡明有所幫助。

人β3-AR的一級(jí)結(jié)構(gòu)由402個(gè)氨基酸組成，分子量為42281，其四級(jí)結(jié)構(gòu)中含20余處疏水區(qū)，最終可以構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)外各4處功能區(qū)。該基因由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成，位于8號(hào)染色體。β3-AR基因編碼區(qū)在第一外顯子第190位點(diǎn)存在T/C多態(tài)性，這個(gè)位點(diǎn)核苷酸由胸腺嘧啶核苷酸到胞嘧啶核苷酸的轉(zhuǎn)變會(huì)引發(fā)β3-AR一級(jí)結(jié)構(gòu)第64位氨基酸密碼子的改變，即由色氨酸密碼子(TGG)改變?yōu)榫彼崦艽a子(CGG)，這一突變會(huì)引起β3-AR的翻譯結(jié)果，改變蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。而這個(gè)因基因突變而變化的氨基酸是位于β3-AR的第1個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)上，第一個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)是β3-AR 完成偶聯(lián)和發(fā)揮效應(yīng)器功能至關(guān)重要的部位[7]。這一氨基酸改變可導(dǎo)致β3-AR活性下降，也就是說(shuō)這一位點(diǎn)變異可以阻礙與脂代謝相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低棕色脂肪和白色脂肪的脂解和產(chǎn)熱效應(yīng)，并降低基礎(chǔ)代謝率，從而導(dǎo)致血脂異常而成為冠心病的高危因素。

要著手研究某候選基因與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性就必須對(duì)冠心病的輕重分度有一個(gè)相對(duì)客觀的方法。眾所周知冠心病臨床表現(xiàn)是多種多樣的，癥狀輕重不一，但冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的病理表現(xiàn)是絕大多數(shù)患者共同具有的。冠狀動(dòng)脈造影一直是冠心病診斷的金指標(biāo)，即使如此，冠脈病變的部位及程度使本病的分度相當(dāng)復(fù)雜，而SYNTAX研究總結(jié)出了一套評(píng)分方案[8]，可以用于評(píng)價(jià)冠狀動(dòng)脈病變的程度，且這一評(píng)分方式綜合考慮了如上所述的冠脈造影結(jié)果的各種復(fù)雜因素，是較為客觀的分度方式，此評(píng)分越高說(shuō)明冠脈病變程度越重，同時(shí)也意味著預(yù)后可能越差[9]。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)此評(píng)分結(jié)果將冠心病組患者分度，所得結(jié)果是有一定可信度的。

事實(shí)上冠心病發(fā)生不僅與遺傳因素有一定的相關(guān)性，還與許多外界因素比如多種環(huán)境因素有關(guān)，β3-AR基因如上位點(diǎn)與冠心病的發(fā)病具有一定程度相關(guān)性而與SYNTAX評(píng)分所示的冠心病輕重程度無(wú)關(guān)，這其中有兩種可能性：其一，冠心病作為一種具有一定程度遺傳傾向的疾病，其發(fā)病也必然是與多種基因變異相關(guān)的，β3-AR基因第一外顯子的第190位點(diǎn)的多態(tài)性可能是與冠心病發(fā)病相關(guān)而與其發(fā)病程度不具相關(guān)性的位點(diǎn)；其二，在冠心病發(fā)生及不斷加重的進(jìn)程中，可能有些許基因水平的因素與之相關(guān)，但諸多后天因素如環(huán)境因素、生活習(xí)慣等也一定是冠心病發(fā)生、進(jìn)展的重要因素[10]，而這些因素在冠心病加重的進(jìn)程中可能所起的作用更大。

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(收稿日期：2014-07-26)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1157-03