高　鵬，王雪野，肖中平，付　堃，孔令環(huán)，王雪梅，李凌君，封　韜，韓　梅

(吉林省人民醫(yī)院 血液科，吉林 長春130021)

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淋巴細胞亞群和調(diào)節(jié)性T細胞在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的表達分析及與預后的關系

高鵬，王雪野，肖中平，付堃，孔令環(huán)，王雪梅，李凌君，封韜，韓梅*

(吉林省人民醫(yī)院 血液科，吉林 長春130021)

摘要：目的通過檢測多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者外周血T、B淋巴細胞及調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)水平，評估MM患者免疫功能狀態(tài)及與預后的關系。方法測定30例MM患者和20例健康志愿者外周血T、B淋巴細胞及Tregs的百分比，分析MM患者血清β2一微球蛋白(β2-MG)、白蛋白(ALB)、血肌酐(CRE)、血紅蛋白(HGB)水平與Tregs的相關性。結(jié)果(1)與對照組比較， MM組患者外周血CD3、CD4比例無統(tǒng)計學意義；NK細胞的比例增高， CD4+CD25highCD127low/-T細胞/CD4+T細胞(Tregs)增高，CD19細胞的比例下降，CD8細胞的比例升高，CD4/CD8比值下降，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0．05)。(2)MM患者外周血Tregs的比例與β2一MG水平成正相關；與血清白蛋白、血紅蛋白、血清肌酐水平無明顯相關性。結(jié)論MM患者外周血淋巴細胞亞群的異常、CD4+CD25highCD127low/-Treg細胞的表達增高，可能是MM患者免疫逃逸和免疫缺陷的主要原因，對判斷MM預后具有一定的參考價值。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1111)

多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是常見于老年人的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，疾病進展較慢，漿細胞異常增殖，單克隆免疫球蛋白增生導致機體細胞免疫和體液免疫功能異常。因此，參與免疫應答的淋巴細胞在多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病中起到了重要作用。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)是一群具有特殊免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，具有負性免疫調(diào)節(jié)作用，在腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用[1]。本研究采用流式細胞術檢測30例MM患者及20例健康志愿者外周血淋巴細胞亞群、Tregs的比例，研究MM患者的免疫功能狀態(tài)，并分析MM患者血清中β2-MG、ALB、HGB、CRE的水平，以探討MM患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞與預后的關系。

1材料與方法

1．1　一般資料

以吉林省人民醫(yī)院血液科2012年1月-2014年6月住院診治的30例多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者做為研究組，依據(jù)國內(nèi)診斷標準診斷為MM[2]。男性20例，女性10例，中位年齡66歲(56-78歲)。根據(jù)國際ISS標準分期：Ⅱ 期12例，Ⅲ 期18例。依據(jù)MM 患者免疫球蛋白進行分型：IgG 型11例、IgA 型14例、IgD 型1例、輕鏈型4例。20例為健康志愿者作為正常對照組，男性12例，女性8例，中位年齡65歲(51-79歲)。

1.2　主要試劑和儀器

CD4-F1TC/CD8-PE/CD3-PC5抗體，CD3-F1TC/CD(16+56)PE，CD3-F1TC/CD19-PE CD4-F1TC，CD25-PE，CDl27-CY5抗體， OptiLyseC血細胞溶血劑，EPICS XL流式細胞儀為美國貝克曼公司產(chǎn)品。全自動生化分析儀(OLYMPUS，2700，日本)，全自動血細胞分析儀(Sysmex XE2100，日本)。

1．3　實驗方法

1．3．1樣本的采集所有觀察對象均于清晨空腹采取靜脈血，分別置于乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝管及生化管中備用。

1．3．2細胞染色①100 μl的外周血中加入CD4-F1TC/CD8-PE/CD3-PC5，CD3-F1TC/CD(16+56)PE，CD3-F1TC/CD19-PE抗體各20 μl，混勻后置室溫避光孵育15 min。②100 μl的外周血中加入CD4-F1TC，CD25-PE，CDl27-CY5抗體各20 μl，混勻后置室溫避光孵育15 min。③加500 μl溶血劑，充分混勻后避光10 min，加適量磷酸鹽緩沖液(PBS)，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加500 μl PBS，上機分析。

1．3．3FCM分析應用EPICS XL流式細胞儀進行檢測，以EXPO32ADCXL4 Color軟件分析結(jié)果，在前向散射角(FSC)和側(cè)向散射角(SSC)散點圖上選定淋巴細胞群，流式細胞術分析MM患者和正常對照外周血CD3、CD4、CD8、NK、CD19的表達，結(jié)果以百分率表示。以CD4設門,分析CD4+細胞上CD25和CD127表達，將CD4+CD25+細胞群熒光強度2倍的細胞群定義為CD4+CD25highT細胞，計算該群細胞在CD4+T細胞上所占的百分比。

1.3.4免疫比濁法檢測MM患者血清β2‐MG 濃度 生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自動生化分析儀(OLYMPUS AU2700 ，日本)運用免疫比濁法檢測MM 患者血清β2‐MG 濃度，以mg/L 表示。

1.3.5溴甲酚綠法檢測MM患者血清ALB濃度生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自動生化分析儀(OLYMPUS AU2700，日本)運用溴甲酚綠法檢測MM 患者血清ALB 濃度，以g/L表示。

1.3.6肌氨酸氧化酶法檢測MM患者血清肌酐水平生化管抽取MM患者空腹外周血3 ml，采用全自動生化分析儀(OLYMPUS 2700 ，日本)運用肌氨酸氧化酶法檢測MM患者CRE，以μmol/L 表示。

1.3.7儀器法檢測MM患者血紅蛋白水平EDTA抗凝管抽取MM患者空腹外周血2 ml，采用全自動血細胞分析儀(Sysmex XE2100，日本)運用儀器法檢測MM 患者HGB，以g/L 表示。

1．4　統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2．1　MM組和健康對照組外周血T細胞和B細胞檢測結(jié)果比較

與健康對照組比較，MM組外周血CD3、CD4表達無統(tǒng)計學意義；NK細胞的表達增高，CD4+CD25highCD127low/-T細胞/CD4+T細胞(Tregs)增高，CD19細胞的表達下降，CD8細胞的表達升高，CD4/CD8比值降低，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)，見表1。

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△P<0．05，與健康對照組比較。

2．2　MM患者外周血Tregs (CD4+CD25highCD127low/-T細胞/CD4+T細胞)的比例與4項生化指標的相關性分析

MM患者外周血Tregs(CD4+CD25highCD127low/-T細胞/CD4+T細胞)的比例分別與血清中β2-MG、ALB、HGB、CRE水平作相關性分析。結(jié)果顯示，MM患者外周血Tregs(CD4+CD25highCD127low/-T細胞/CD4+T細胞)的比例與β2-MG濃度(r=0.769 ，P<0．01)成正相關；與血清ALB、HGB、CRE水平無明顯相關性，見表2。

表2　MM患者外周血Tregs的比例與生化指標的相關性

3討論

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是漿細胞惡性腫瘤，異常免疫球蛋白克隆性增生，正常免疫球蛋白受到抑制，導致免疫功能異常。近年來，隨著醫(yī)學免疫學的飛速發(fā)展，對MM患者細胞及體液免疫功能的研究也不斷深入。國內(nèi)外研究者發(fā)現(xiàn)MM患者體內(nèi)免疫系統(tǒng)存在多種缺陷，包括免疫細胞如B細胞、T細胞、NK細胞及DC細胞的數(shù)量異常以及功能缺陷，還存在調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的異常等[4]。MM的預后因素復雜，包括年齡，漿細胞標記指數(shù)，血紅蛋白水平，血小板計數(shù)，白蛋白、β2-MG、肌酐水平，乳酸脫氫酶，細胞遺傳學和分子標記等。血清β2-MG水平能反映骨髓瘤細胞總量，與白蛋白共同構(gòu)成了國際分期標準(ISS)。MM細胞分泌的單克隆免疫球蛋白導致游離輕鏈增高，對腎小管上皮細胞造成毒性作用，導致了MM腎臟損害。MM細胞在骨髓腔內(nèi)浸潤，細胞因子水平升高，抑制了正常的紅系造血；腎功能異常導致促紅細胞生成素生成不足；化療導致骨髓抑制等多種因素引起多發(fā)性骨髓瘤患者出現(xiàn)不同程度的貧血。MM患者免疫功能異常，而調(diào)節(jié)性T細胞與上述各種生化指標的相關性研究較少，因此本研究進行二者的相關性研究，以探討調(diào)節(jié)性T細胞與疾病預后的關系。

參與免疫應答的細胞是免疫細胞，免疫細胞包括固有免疫細胞和特異免疫細胞，特異免疫細胞包括T細胞和B細胞，NK細胞以及樹突細胞、白細胞等屬于固有免疫細胞。腫瘤患者體內(nèi)的抗腫瘤免疫應答主要由T細胞發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)機體免疫應答和維持免疫穩(wěn)定，其中CD4+T細胞主要為輔助性T細胞(Th)，是免疫應答中的主要反應細胞；而CD8+T細胞主要由細胞毒性T細胞和抑制性T細胞組成，對靶細胞產(chǎn)生細胞毒作用。CD4/CD8比值可反映機體細胞免疫功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，MM患者外周血CD8+T細胞表達明顯增高，且CD4+/CD8+比值降低，與Oken報道一致[5]，存在Tregs增高，CD19細胞的表達下降，說明MM患者機體存在細胞免疫及體液免疫的功能紊亂，導致了MM的發(fā)病。

NK細胞來源于造血干細胞，其表面標志是CD56，其無需激活即可直接殺傷腫瘤細胞及被感染細胞，具有MHC非限制性。Bernal等[6]研究表明MM患者外周血NK細胞數(shù)量增多,但活性降低。Jurisic等[7]的研究證實MM患者NK細胞活性下降與疾病進展及骨髓漿細胞浸潤程度關系密切。我們以CD16及CD56為NK細胞的標志，研究表明，MM患者外周血NK細胞比例較對照組增高，與上述報道一致。下一步準備進行NK細胞活性的測定，以評估其在MM發(fā)病的免疫機制方面的作用。

B細胞占人外周血淋巴細胞的5%-25%，是抗體產(chǎn)生細胞，通過中和作用、調(diào)理作用、激活補體的方式介導體液免疫應答。此外，B細胞可加工提呈可溶性抗原給T細胞，活化的B細胞還可以分泌各種細胞因子調(diào)節(jié)機體免疫功能、參與造血。本研究結(jié)果顯示，MM患者體內(nèi)CD19細胞的表達明顯低于正常對照組。說明MM患者機體可能存在體液免疫功能的低下和免疫調(diào)節(jié)功能的異常。

1995年Sakaguchi[8]等發(fā)現(xiàn)在人類和小鼠外周血中CD4+CD25+Treg細胞占CD4+T細胞的5%-10%，是T細胞中的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞亞群，具有免疫無能性和免疫抑制兩大功能特征[9]。許多研究報道腫瘤患者的Tregs細胞有不同程度的增多[10]，是腫瘤免疫逃逸的主要機制之一。而這群細胞中具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)性T細胞集中在CD4+CD25highT細胞中。Khattri[11]等發(fā)現(xiàn)Treg細胞特異表達轉(zhuǎn)錄抑制因子Foxp3。Beyer[12]等證實MM患者CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞增多。Liu等[13]研究表明Foxp3高表達和CDl27(IL-7受體)低表達之間存在良好的相關性，因此CD4+CD25highCDl27low/-T細胞也可以反映此Tregs群體。本研究結(jié)果顯示，MM患者外周血CD4+CD25highCD127low/-T細胞比例明顯高于正常對照組，且與血清中β2-MG濃度成正相關。說明MM患者體內(nèi)存在CD4+CD25+Treg細胞異常擴增，可能是MM免疫逃逸的一個重要機制，可考慮作為判斷預后的一個輔助指標。

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關鍵詞：多發(fā)性骨髓瘤；T淋巴細胞亞群；調(diào)節(jié)性T細胞

Analysis of T Lymphocyte Subsets and Tregs in Peripheral Blood of Patientswith Multiple Myeloma and its Correlation with Prognostic FactorsGAOPeng，WANGXue-ye，XIAOZhong-ping，etal.(DepartmentofHematology,JilinProvincePeople′sHospital，Changchun130021，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate immune state and analyze its prognostic function of patients with MM by detect the changes of the T lymphocyte subsets,B cells and Tregs in peripheral blood of patients with MM．MethodsThe percentage of T lymphocyte subsets,B cells and Treg cells in peripheral blood of 30 patients with MM and 20 healthy donors was measured．The association of Tregs of the MM patients with β2-MG,serum albumin,serum creatinine,hemoglobin were analyzed.ResultsCompared with the control group，the percentage of CDl9，CD4/CD8 were reduced and the percentage of the CD8，NK，CD4+CD25highCD127low/-T cells/CD4+T cells(Tregs) was elevated in patients with MM(P<0．05)．The Treg cells had positive correlation with the level ofβ2-MG and had negative correlation with the level of serum albumin,hemoglobin,serum creatinine．ConclusionMM Patients have a disorder of lymphocyte subsets and have an abnormal amplification of CD4+CD25highCD127low/-Treg cells，which may be an important mechanism of MM immune deficiency and immune escape.It had certain reference value in judging the prognosis of the patients with MM.

Key words:multiple myeloma；T lymphocyte subsets；Tregs

(收稿日期：2014-08-24)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R733.3

文章編號：1007-4287(2015)07-1111-04

*通訊作者

基金項目：吉林省科技廳立項課題(201215201)