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CKS1siRNA聯(lián)合化療藥物對舌癌Tca8113細胞中CKS1蛋白表達影響的研究

徐亞娟1,李兆東2,高元奇2,張叢笑3,倫志軍3,畢崇才3,劉文書3*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院,吉林 長春130012；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 長春130021；

3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長春130021)

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，治療效果不理想。目前，舌癌的治療主要是以手術(shù)和放、化療為主[1]，其中化療是目前有效綜合治療舌癌的一個重要的方法，但化療藥物的應(yīng)用存在耐藥和毒副作用等，限制了其用量和時間[2,3]。近年來的研究表明[4]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是細胞周期調(diào)控因子異常導(dǎo)致的細胞周期紊亂，因此，尋找有關(guān)的調(diào)控因子，并將其作為目的基因與放化療相結(jié)合，對腫瘤治療具有重要意義。

CKS1是細胞周期蛋白依賴性激酶的亞基，能與其他細胞周期蛋白激酶和磷酸化蛋白結(jié)合，參與細胞周期調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。現(xiàn)在的研究擬通過CKS1 siRNA轉(zhuǎn)染Tca8113細胞并加用化療藥物，以觀察CKS1 siRNA對化療藥物的增效作用。

1材料與方法

1.1　實驗材料

人舌癌Tca8113細胞系購自北京博楓科生物科技有限公司，DMEM培養(yǎng)液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。平陽霉素(哈爾濱萊博通藥業(yè)有限公司)，順鉑(山東羅欣藥業(yè)股份有限公司)，氟尿嘧啶(修正藥業(yè)集團股份有限公司)，長春新堿(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，胰蛋白酶(蘇州新寶制藥有限公司)。

1.2　實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人舌癌Tca8113細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至90%匯合時，用0.25%胰酶(含1% EDTA)消化，經(jīng)離心后制成單細胞懸液，以1∶4比例傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2CKS1 siRNA 轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA有意義鏈：5’-UGGAGGAAUCUUGGCGUUCUUTT-3’；對照鏈：5’-UUCUUCGAACGUGUCACGUTT-3’由上海GenePharma公司合成，同時對siRNA序列進行2'Ome修飾(穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu))和5'FAM修飾(綠色熒光)，具體實驗操作嚴格按GenePharma siRNA-MateTM和siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑盒進行。

1.2.3化療藥物對Tca8113細胞的作用將Tca8113細胞培養(yǎng)于96孔板，細胞分為：空白組、轉(zhuǎn)染組、平陽霉素組、順鉑組、氟尿嘧啶組、長春新堿組、平陽霉素+siRNA組、順鉑+siRNA組、氟尿嘧啶+siRNA組、長春新堿+siRNA 組共10組，每組3個復(fù)孔。細胞以每孔5×103個接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染聯(lián)合化療藥物組細胞先進行CKS1-siRNA轉(zhuǎn)染，濃度為10 nM；其他各組正常培養(yǎng)。24 h后，藥物組分別加入4種藥物，具體濃度梯度按表1進行。

表1　4種化療藥物的配制濃度

加藥后繼續(xù)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后每孔加MTT溶液(5 mg/mL)20 μl，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液后再加入150 μl DMSO，震蕩10 min，于酶標儀(490 nm波長)測定各孔吸光值(OD值)，計算抑制率并根據(jù)公式計算轉(zhuǎn)染前后各組細胞的半致死量(IC50)，同時根據(jù)半致死量的值用于后續(xù)實驗。

1.2.4化療藥物對轉(zhuǎn)染后Tca8113細胞的CKS1蛋白表達水平檢測細胞培養(yǎng)及操作方法同前。然后收集細胞，提取蛋白質(zhì)并對蛋白質(zhì)進行定量和變性，通過常規(guī)SDS-PAGE和Western blot對轉(zhuǎn)染后給予不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白表達進行檢測。

2結(jié)果

2.1　轉(zhuǎn)染前后4種化療藥物對Tca8113細胞的半數(shù)致死量

實驗結(jié)果如表2所示，轉(zhuǎn)染CKS1 siRNA后，各化療藥物對Tca8113細胞的半致死劑量明顯低于未轉(zhuǎn)染組，其中以順鉑組差異更明顯。

2.2　轉(zhuǎn)染后4種化療藥物對Tca8113細胞CKS1蛋白表達水平的影響

圖像經(jīng)Imagej軟件分析灰度值，進行半定量分析。各組之間的比值差異2倍以上認定為有顯著性差異。實驗結(jié)果如表3、圖1所示，轉(zhuǎn)染后再加入4種不同化療藥物的Tca8113細胞CKS1蛋白水平顯著下降，與對照和轉(zhuǎn)染siRNA組比較均有顯著性差異(P<0.05)，其中，藥物聯(lián)合siRNA協(xié)同作用對CKS1蛋白水平影響的強度由弱到強依次為：氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA，平陽霉素聯(lián)合siRNA，長春新堿聯(lián)合siRNA，順鉑聯(lián)合siRNA。

表2　轉(zhuǎn)染前后四種化療藥物對Tca8113細胞的

表3　藥物聯(lián)合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

—：轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體的對照組； N：轉(zhuǎn)染siRNA組； Cks：Cks1 siRNA轉(zhuǎn)染組；1：順鉑聯(lián)合siRNA組；

2：平陽霉素聯(lián)合siRNA組；3：長春新堿聯(lián)合siRNA組；4.氟尿嘧啶聯(lián)合siRNA組

圖1藥物聯(lián)合siRNA對Tca8113細胞Cks1蛋白水平的影響

3討論

惡性腫瘤的目前基因治療有如抑癌基因的附加、癌基因的抑制等[6],但由于腫瘤發(fā)病的多基因和多因素等原因，使基因治療的應(yīng)用受到限制。因此，將抗腫瘤相關(guān)基因與現(xiàn)在治療方法相結(jié)合使其能更好地發(fā)揮療效，是提高化療藥物對舌癌的敏感性的一個重要途徑。

2001年Ganoth等[7]首次發(fā)現(xiàn)cks1蛋白具有促進p27蛋白泛素化降解功能。P27被認為是一種抑癌基因。此外還具有調(diào)節(jié)腫瘤的耐藥、促進凋亡、誘導(dǎo)分化等作用。張秀梅等[8]應(yīng)用免疫組化和流式細胞術(shù)對肝癌和胃腺癌中的CKS1及CKS1、P27蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)在腫瘤中CKS1的表達增高，P27的表達降低，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、浸潤程度等有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)[9]，CKS1對細胞周期各個時相G1、S、G2、M期都有作用，其可能促進G2/M期的細胞周期激酶抑制劑P27的集聚。本研究結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染后細胞的半數(shù)致死劑量明顯低于轉(zhuǎn)染前，藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞的CKS1蛋白表達顯著下降，表明藥物聯(lián)合siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制CKS1蛋白表達，可能通過防止p27蛋白泛素化降解，抑制腫瘤發(fā)展。為應(yīng)用CKS1 siRNA治療舌癌的研究提供了進一步實驗的證據(jù)。

參考文獻：

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[8]張秀梅，顧金松，劉曙，等.老年肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].中國腫瘤外科雜志，2013,5(4)：239.

[9]Hoellein A,Graf S,Bassermann F,et al.Cks1 promotion of S phaseentry and proliferation is dependent of p27kip1 suppression[J].Mol cell Biol,2012,32(13):2416.

(收稿日期：2015-02-08)

文章編號：1007-4287(2015)07-1054-03

*通訊作者

基金項目:吉林省發(fā)展和改革委員會資助(JF2012C006-8)