傅建華，王海東，徐偉偉，周　孟，王世勇

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 廣州 580001;

2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 廣州 580001)

RNA干擾pygo2基因?qū)θ四X膠質(zhì)母細胞瘤U251生物學(xué)行為及wnt通路的影響

傅建華1，王海東2*，徐偉偉2，周孟2，王世勇2

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 廣州 580001;

2.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 廣州 580001)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0349)

pygo2基因是近年新發(fā)現(xiàn)的wnt信號系統(tǒng)中重要功能蛋白[1]，已有的研究結(jié)果表明pygo2與wnt信號及多種惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[2]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)pygo2基因在腦膠質(zhì)瘤中有高表達[3]，本研究擬采用RNAi技術(shù)敲除膠質(zhì)瘤細胞中pygo2表達，研究pygo2表達下調(diào)對腫瘤細胞惡性表型的影響，以明確其與腦膠質(zhì)瘤惡性發(fā)生之間的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤基因治療提供新的靶點 。

1材料與方法

1．1材料

U251人腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞系購自中國科學(xué)院細胞庫，siRNA-pygo2質(zhì)粒由本實驗室合成 ，轉(zhuǎn)染劑lipofectamine購自美國invitrogene公司，羊抗人pygo2多克隆抗體(Santa Cruz，)， c-myc、p53 兔抗人多克隆抗體 (CST 公司)，GAPDH 、Cyclin D1 鼠抗人多克隆抗體 (Santa Cruz 公司)，辣根過氧化物酶標記的二抗 (Zymed，San Diego 公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及實驗分組①培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2濕潤培養(yǎng)。②實驗分組：本實驗所有指標檢測都按照如下分組：空白對照組、無義序列siRNA組、轉(zhuǎn)染pygo2 siRNA組(pygo2 siRNA)。使用lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染siRNA。反義 pygo2由上海吉瑪制藥公司合成。序列為5′-TGTTCGCACCTGTTACCTGCCACTAC-3′，無義序列為5′-GCACCAGACAAGCGGGGACAAAG-3′。方法見文獻[4]。

1.2.2MTT法分析細胞增殖活性U251 細胞系接種于 96 孔板，轉(zhuǎn)染siRNA 48 h 后使用 MTT 進行細胞增殖實驗。酶標儀在 490 nm 處檢測各孔吸光度值，數(shù)據(jù)取至少 6 個孔的均值。

1.2.3流式細胞技術(shù)分析細胞周期采用 FACS Calibur 流式細胞儀 (BectonDickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA) 檢測細胞周期，并通過 Modifit 軟件 (Becton Dickinson)分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.4細胞侵襲分析Transwell小室侵襲實驗步驟如下：實驗采用8 μm孔徑的transwell小室，小室的底部已用matrigel基質(zhì)覆蓋。首先將上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA-pygo2的U251細胞(高表達pygo2)及其空白質(zhì)粒對照細胞計數(shù)后種植于transwell小室中。孵育48 h后取出transwell小室， 將穿出小室位于膜下層的細胞進行固定和染色，顯微鏡下每孔隨機取10視野計數(shù)后進行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù) 3 次。

1.2.5Western blot 分析U251 細胞系經(jīng)對照、無關(guān)序列及反義 pygo2轉(zhuǎn)染 48 h 后，收取樣本用于 Western blot 分析。一抗為兔抗人抗 c-myc、鼠抗人 Cyclin D1(1∶1000 稀釋)、β-catenin (1∶1000 稀釋),結(jié)果通過Super-Signal 蛋白檢測試劑盒 (Pierce，USA) 檢測。

1.2.6統(tǒng)計方法所獲的數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。細胞周期用卡方檢驗，MTT、western blot、平板克隆及侵襲能力用方差分析，P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT結(jié)果

顯示RNAi干擾pygo2表達后，細胞的增殖活性明顯受到抑制。轉(zhuǎn)染后3天，無義序列siRNA轉(zhuǎn)染組細胞的生長未受到明顯抑制，而pygo2 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞的生長在轉(zhuǎn)染后第四天出現(xiàn)明顯的生長抑制，且隨時間的推移，抑制程度越發(fā)明顯(圖1)。

圖1　MTT法測定不同組的細胞生長曲線

2.2細胞周期

流式細胞術(shù)檢測細胞周期時相分布，發(fā)現(xiàn)對照組細胞G0/G1期、S期、G2/M期所占比例分別是48.8%、33.7%、18.9%,無義序列 siRNA轉(zhuǎn)染組分別為47.7%、34.5%、16.1%。而siRNA pygo2轉(zhuǎn)染組分別為65.8%、17.7%、14.2%?？梢?，pygo2表達敲低后出現(xiàn)細胞周期阻滯，從而延緩細胞周期進展，抑制細胞增殖(圖2，3)。

圖2　流式細胞儀記錄不同組的細胞周期分布

圖3　用流式細胞儀檢測細胞周期分布

2.3細胞侵襲性生長受到抑制

Matrigel 侵襲生長實驗可見對照組、mismatch siRNA組和pygo2 siRNA 干擾組細胞數(shù)分別為122.8±8.6、118.2±6.5和31.4±5.2，pygo2 siRNA組細胞數(shù)明顯減少，與對照組和無義序列組相比差異顯著(P<0.01)(圖4)。

圖4　干擾后第七天試驗組與對照組相比細胞侵襲性明顯下降

2.4western blot檢測β-catenin、 cyclinD1表達

Western免疫印跡證實，與未轉(zhuǎn)染組比較，pSUPER-pygo2能顯著下調(diào)pygo2蛋白的表達(P<0.05),同時cyclinD1、c-myc的表達水平也下調(diào)(P<0.05)，但未能探及β-catenin表達變化(P>0.05)(圖5)。

圖5　各組細胞Pygo2,CyclinD1 和C-myc表達

3討論

腦膠質(zhì)細胞瘤簡稱膠質(zhì)瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)高度惡性腫瘤，臨床采用手術(shù)、放療、化療等綜合治療，效果均不理想。膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因目前尚不清楚，但有證據(jù)表明膠質(zhì)瘤的形成與多種基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),如Wnt、TGF-β、Hedgehog、Notch等。其中以Wnt信號最為典型。Howng[5]等,研究顯示wnt5a、wnt10b和wnt13在大多數(shù)腦腫瘤中高表達，而wnt1在各種腫瘤中低表達。 Pu[6]等發(fā)現(xiàn)wnt2、wnt5a 、Fz2在正常腦組織中無表達，而在腦膠質(zhì)瘤中高表達，并且表達水平和腫瘤級別密切相關(guān)。Utsuki[7]等通過免疫組化檢測45例腦膠質(zhì)瘤中β-catenin，N-cadherin表達，發(fā)現(xiàn)其表達水平和腫瘤惡性程度密切相關(guān)。

Pygo2基因是wnt信號通路新發(fā)現(xiàn)的核心蛋白。 Barry[8]等通過對直腸癌細胞系進行Pygo基因的RNA干擾及補救實驗，證實Pygo2是wnt信號中TGF介導(dǎo)的癌基因轉(zhuǎn)錄過程中不可缺少的。 我們前期報道了其在腦膠質(zhì)瘤中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在惡性膠質(zhì)瘤中顯著高表達，并隨著腫瘤惡性程度的增加而表達增強[3]。本研究通過U251細胞轉(zhuǎn)染pygo2 siRNA表達質(zhì)粒，有效的抑制了pygo2基因的表達，同時引起了細胞增殖能力減弱，相應(yīng)的細胞周期阻滯。提示其在腦膠質(zhì)瘤惡性演變中具有重要作用，可能是腦膠質(zhì)瘤治療的新的靶點。

CyclinD1是和細胞增殖有關(guān)的關(guān)鍵蛋白。我們研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA敲低U251細胞pygo2的表達后，cyclinD1表達下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)細胞周期阻滯于G0/G1期。

轉(zhuǎn)染靶向pygo2的siRNA能有效降低其蛋白表達，并由此抑制了wnt靶基因cyclinD1、c-myc的表達，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖能力和侵襲能力下降，我們同時檢測了wnt信號關(guān)鍵調(diào)控基因β-catenin的表達變化，卻未發(fā)現(xiàn)其表達受到抑制。該結(jié)果提示pygo2是wnt信號的下游蛋白，不依賴β-catenin來調(diào)控wnt信號下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，pygo2抑制腫瘤細胞增殖的作用可能是通過降低wnt信號靶基因cyclinD1、c-myc表達實現(xiàn)的。這一發(fā)現(xiàn)和Pu[6]等的研究結(jié)果相似。

綜上，本實驗明確了pygo2在腦膠質(zhì)瘤惡性演變中的作用及可能機制,針對pygo2的RNA干擾，在wnt信號的β-catenin下游水平對靶基因的表達產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，這些對于膠質(zhì)瘤生物基因治療的基因靶向策略具有重要意義。

參考文獻：

[1]Barry Thompson,Fiona Townsley,Rina Rosin-Arbesfeld,et al.A new nuclear component of the Wnt signalling pathway [J].Nature cell biology,2002,5:367.

[2]Andrews PG,Lake BB,Popadiuk C,et al.Requirement of pygopus 2 in breast cancer[J].International Journal of Oncology,2007,30:357.

[3]王海東,杜天明,項永生,等.Wnt信號調(diào)控因子Pygo2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達及意義[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2010，13(6)：513.

[4]王海東,蘇新輝,王占祥.Pygo2基因RNA干擾真核表達載體pSUPER.puro- Pygo2的構(gòu)建[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2009，12(4)：121.

[5]Howng SL,Wu CH,Cheng TS,et al.Differential expression of wnt genes,β-catenin and E-caderin in human brain tumors[J].Cancer Lett,2002,183:95.

[6]P Pu,Z Zhang,C Kang,et al.Down regulation of wnt2 and β-catenin by siRNA suppresses malignant glioma cell growth[J].Cancer gene therapy,2009,16(4):351.

[7]Utsuki S，Sato Y，Oka H，et al．Relationship between the expression of E-，N-cadherins and beta-catenin and tumor grade in astrocytomas[J].Neurooncol,2002,57(3):1251.

[8]Lake BB,Kao KR.Pygopus is required for embryonic brain patterning in Xenopus [J].Dev Biol,2003,261(1):132.

[9]Andrews PG,Lake BB,Popadiuk C,et al.Requirement of Pygopus 2 in breast cancer [J].Int J Oncol,2007,30(2):357.

[10]Popadiuk CM,Xiong J,Wells MG,et al.Antisense suppression of pygopus 2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(7 Pt 1):216.

摘要：目的研究 pygo2在膠質(zhì)瘤細胞系 U251中的表達、功能及作用機制。方法利用反義 pygo2轉(zhuǎn)染 U251，下調(diào) pygo2的表達，應(yīng)用流式細胞術(shù)和 MTT 法，評價細胞生長、增殖、凋亡及周期變化；細胞克隆形成試驗和transwell侵襲試驗分析細胞的克隆形成能力和侵襲能力，采用Western 印跡法檢測通路蛋白的表達變化。 結(jié)果轉(zhuǎn)染反義 pygo2后，pygo2表達降低，MTT 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染反義 pygo2后細胞生長受到抑制且凋亡細胞增加；流式細胞術(shù)提示G1期到S期阻滯， 細胞克隆形成能力下降，侵襲能力均受到抑制，Western 結(jié)果表明wnt通路相關(guān)蛋白c-myc 和 Cyclin D1 在抑制pygo2表達后下降。結(jié)論pygo2可促進人腦膠質(zhì)瘤細胞生長、增殖，可能是膠質(zhì)瘤治療的有效靶點，其發(fā)揮作用可能與 wnt 通路密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：pygo2；膠質(zhì)瘤;RNA干擾;wnt

RNA i down-regulate pygo2 to effect biological behavior of U251 and wnt passwayFUJian-hua,WANGHai-dong,XUWei-weietal.(NeurosurgeryDepartment,JinanUniversityAffiliatedFirstHospital,Guangzhou580001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the expression,function and mechanism of pygo2 in the treatment for glioma cell line U251.MethodsAntisense pygo2 was used to transfect U251 and down regulate pygo2 expression,and flow cytometry and MTT were used to evaluate cell growth,proliferation,apoptosis and cell cycle changes.meanwhile，cell colony formation assay and invasion ability were tested,as well as westblotting was used to detetect changes of passway protein.ResultsAfter transfection of antisense pygo2,pygo2 was down regulated,MTT revealed cell proliferation was inhibited and apoptosis cells increased.flow cytometry revealed G1 to S stage arrest,both colony formation ability and invasion ability were inhibited,western blot showed wnt passway associated proteins,c-myc,cyclinD1 were decreased by knockdown of pygo2 e xpression.Conclusionpygo2 could promote growth,proliferation ，and was possibly an effective candidate for glioma treatment,the mechanism may be closely related with wnt signal passway.

Key words:pygo2;giloma;RNA i;wnt

收稿日期：(2014-05-24)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R739.41

文章編號：1007-4287(2015)03-0349-04

通訊作者*

基金項目：廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研課題資助(A2012330)；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研培育基金資助