史　琦，胡元會，李友林，吳華芹，禇瑜光，齊連芬

芪竭乳沒膠囊對載脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及炎癥反應(yīng)的影響

史琦1，胡元會2，李友林1，吳華芹2，禇瑜光2，齊連芬2

摘要：目的觀察芪竭乳沒膠囊對載脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及炎癥反應(yīng)的影響。方法8周齡ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)，芪竭乳沒膠囊連續(xù)灌胃30 d后，酶法及選擇性沉淀法測定血清血脂含量，免疫組化染色法測定主動脈內(nèi)膜及動脈粥樣硬化(AS)斑塊內(nèi)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)。結(jié)果芪竭乳沒膠囊大、小劑量組小鼠血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)；芪竭乳沒膠囊大、小劑量組小鼠主動脈內(nèi)膜及AS斑塊內(nèi)TNF-α的表達(dá)與模型組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論芪竭乳沒膠囊能明顯降低ApoE-/-小鼠血清TC、TG及LDL-C，抑制ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜、AS斑塊內(nèi)TNF-α的表達(dá)，通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生發(fā)揮其阻止AS發(fā)生發(fā)展的作用。

關(guān)鍵詞：動脈粥樣硬化；載脂蛋白E基因敲除小鼠；芪竭乳沒膠囊；血脂；炎癥反應(yīng)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是發(fā)生在大、中血管的一種慢性特異性炎癥，脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致AS發(fā)病的主要機(jī)制之一，而易損斑塊的破裂合并血栓形成是造成心血管急性臨床事件的重要病理基礎(chǔ)[1]。中醫(yī)藥在動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療中顯示出舉足輕重的作用，特別是隨著毒邪學(xué)說研究的不斷深入，動脈粥樣硬化從痰瘀毒論治已成為值得深入研究的重要課題，但是從“益氣托毒”的角度探討并治療動脈粥樣硬化的報道較少見。以往文獻(xiàn)報道中認(rèn)為黃芪、血竭、乳香和沒藥具有良好的降脂和抗動脈粥樣硬化作用[2-4]。本研究進(jìn)一步分析益氣托毒中藥的有效成分對載脂蛋白E(ApoE)基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化的干預(yù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

作者單位：1.中日友好醫(yī)院(北京 100029)；2.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院

1材料與方法

1.1實驗動物8周齡載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-小鼠)33只，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物科學(xué)部提供，雄性，體重20 g～27 g，正常C57BL/6小鼠11只。ApoE-/-小鼠飼以“西方類型膳食”飼料，膽固醇含量0.15%，脂肪含量21%；普通二級清潔飼料喂養(yǎng)正常C57BL/6小鼠。國家二級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件，室溫22 ℃～24 ℃，相對濕度50%，光照時間07：00～19：00，自由進(jìn)食、進(jìn)水。

1.2藥品及試劑芪竭乳沒膠囊由黃芪多糖、血竭黃酮、乳香油、沒藥油按照一定比例組成，購自陜西森弗生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號黃芪多糖：20060201，血竭黃酮：20070306，乳香油、沒藥油：20060802。0.9%氯化鈉注射液，雙鶴制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：0506042。SABC免疫組化染色試劑盒、一抗兔抗鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體，武漢博士德生物工程有限公司；總膽固醇(TC)試劑盒、三酰甘油(TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司。

1.3主要儀器設(shè)備IX-70熒光倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS)；RM2135石蠟切片機(jī)(德國 LEICA)；亞鵬CS-Ⅲ生物組織攤片烤片機(jī)(湖北省醫(yī)用電子儀器廠)；VANOX顯微照相系統(tǒng)(日本 OLYMPUS)；圖像分析軟件(美國 Image-Pro Plus Version 4.5.1)。

1.4方法

1.4.1分組及給藥將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組、芪竭乳沒膠囊大劑量組、芪竭乳沒膠囊小劑量組，每組11只；C57BL/6小鼠11只為正常組。芪竭乳沒膠囊的劑量根據(jù)以往實驗研究中的平均灌胃劑量，同時結(jié)合臨床中用藥習(xí)慣，黃芪多糖1 g/kg～2 g/kg，血竭黃酮200 mg/kg～400 mg/kg，乳香油、沒藥油150 mg/kg～300 mg/kg，均以0.9%氯化鈉注射液溶解后灌胃，劑量為0.1 mL/10 g體重，每日1次。正常組和模型組予以等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。44只小鼠均連續(xù)灌胃30 d。

1.4.2標(biāo)本取材取材前夜禁食禁水，次日采用眼球摘除取血法處死，每只小鼠取血不少于0.8 mL。血樣靜置2 h后高速離心(3 000 r/min)，分離上層血清。迅速剪開胸腔暴露心臟，直視下取出心臟及主動脈，從主動脈根部取至主動脈弓，剝離血管外附著組織，生理鹽水沖洗，4%甲醛溶液固定保存。

1.4.3檢測指標(biāo)及測定方法TC、TG以酶法測定，LDL-C用選擇性沉淀法測定。每組隨機(jī)選取6只小鼠的心臟及主動脈標(biāo)本，應(yīng)用德國LEICA石蠟切片機(jī)制備連續(xù)切片，從冠狀動脈與主動脈的開口處連續(xù)切至心尖，每只小鼠切片50張，每張切片2個組織面，每張切片厚5 μm，間隔6張取1張。采用抗生物素蛋白-生物素-氧化物酶復(fù)合體法(ABC法)檢測主動脈根部動脈粥樣斑塊內(nèi)及主動脈內(nèi)膜TNF-α的表達(dá)，抗體稀釋度均為1∶200。光鏡下觀察免疫組化切片，黃褐色顆粒為陽性表達(dá)?！?00倍光鏡下，每張切片取5個視野，IPP圖像分析軟件統(tǒng)計陽性表達(dá)光密度值(IOD)。

2結(jié)果

2.1芪竭乳沒膠囊對ApoE-/-小鼠血脂的影響(見表1)ApoE基因缺陷小鼠飼以“西方類型膳食”30 d后，模型組血清TC、TG、LDL-C水平較正常組明顯升高(P<0.01)。芪竭乳沒膠囊大、小劑量組小鼠血清TC、TG及LDL-C含量較模型組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，特別是降低血清TG及TC的作用更加明顯，芪竭乳滑膠囊大、小劑量組的降脂作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1　芪竭乳沒膠囊對ApoE-/-小鼠血脂的影響(±s) 　mmol/L

2.2芪竭乳沒膠囊對ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜及斑塊內(nèi)TNF-α表達(dá)的影響芪竭乳沒膠囊大、小劑量組小鼠主動脈內(nèi)膜TNF-α陽性表達(dá)光密度值與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。ApoE-/-小鼠主動脈根部AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)中心細(xì)胞壞死區(qū)、泡沫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)均可見明顯的TNF-α表達(dá)。灌胃30 d后，芪竭乳沒膠囊大、小劑量組AS斑塊內(nèi)TNF-α的表達(dá)有不同程度的降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2、圖1。

表2　芪竭乳沒膠囊對ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜及

注：A 為正常組；B、E、F 為模型組；C、G 為芪竭乳沒膠囊大劑量組；D、H 為芪竭乳沒膠囊小劑量組。

圖1各組小鼠主動脈內(nèi)膜及斑塊內(nèi)TNF-α的表達(dá)

3討論

隨著AS研究的不斷深入，很多學(xué)者認(rèn)同痰濁、瘀血、熱毒均與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且三者并非孤立存在。津血同源，痰瘀相關(guān)，痰瘀互結(jié)，郁久腐化，漸則凝聚成毒，從而形成痰瘀毒相互膠結(jié)的病理局面[5]。實驗之初，通過對比外科“瘡瘍”和動脈粥樣硬化的病因病機(jī)，發(fā)現(xiàn)兩者從發(fā)病機(jī)制到治療原則均存在相似之處，因此考慮以外科常用之“托毒法”應(yīng)用于AS的治療，并在“補(bǔ)氣活血，去腐生肌”治療原則下，選取具有“益氣托毒”作用的黃芪、血竭、乳香和沒藥作為實驗用藥。

脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致AS發(fā)病的主要機(jī)制之一。降脂治療可通過減少斑塊內(nèi)脂質(zhì)沉積，促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，減少斑塊內(nèi)膽固醇酯濃度，增加斑塊穩(wěn)定性[6]。吳勇[7]證實了黃芪多糖(APS)對糖尿病大鼠微血管病變的影響以及對糖尿病高血脂具有治療作用。研究發(fā)現(xiàn)：乳香油、沒藥油樹脂部分能降低血膽固醇，防止動脈內(nèi)膜粥樣斑塊的形成[8]。盧文田[4]用血竭膠囊治療缺血性心臟病，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用血竭膠囊，癥狀改善快，降脂作用好。此次實驗以芪竭乳沒膠囊干預(yù)ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化過程，結(jié)果顯示：芪竭乳沒膠囊對AS小鼠血清TC、TG、LDL-C水平有不同程度的降低作用，尤其以降低TG和TC水平更為明顯。

炎癥是動脈粥樣硬化的形成機(jī)制之一，也是易損斑塊的重要特征。TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，具有多種生物活性，不僅具有抗腫瘤、參與免疫調(diào)節(jié)、影響脂質(zhì)和糖代謝過程、參與機(jī)體損傷病理生理過程，而且能介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、前列環(huán)素等多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，是具有廣泛影響的有效的促炎癥性細(xì)胞因子。其存在于AS的損傷部位，介導(dǎo)和放大了許多相互作用，導(dǎo)致炎癥發(fā)展、斑塊不穩(wěn)定和促血栓形成傾向[9]。此外，TNF-α還可活化內(nèi)皮細(xì)胞，引起細(xì)胞壞死、氧化應(yīng)激、血小板聚集，血栓形成，誘發(fā)ACS發(fā)生[10]。Anwar等[9]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在急性和慢性冠脈綜合征中通過降低血管平滑肌細(xì)胞的活性而促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定進(jìn)而出現(xiàn)破裂。

本實驗觀察了ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜及AS斑塊內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示芪竭乳沒膠囊可以顯著降低ApoE-/-小鼠主動脈內(nèi)膜及AS斑塊內(nèi)TNF-α的表達(dá)，表明芪竭乳沒膠囊可以通過抑制炎癥反應(yīng)從而發(fā)揮阻止動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展及穩(wěn)定斑塊的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Naghavi M，Libby P，F(xiàn)alk E，et al.From vulnerable plaque to vulnerable patient：a call for new definitions and risk assessment strategies[J].Circulation，2003，108(14)：1664-1672.

[2]周俊琴，夏先明，薛志權(quán)，等.丹參黃芪配伍對家兔低密度脂蛋白受體的影響[J].中藥藥理與臨床，2004，20(5)：5-7.

[3]葉建紅.對藥乳香沒藥的藥理作用與臨床應(yīng)用體會[J].安徽中醫(yī)臨床雜志，2003，15(3)：264-265.

[4]盧文田.血竭膠囊治療缺血性心臟病45例觀察[J].臨床薈萃，2001，16(12)：562.

[5]于俊生，王硯琳.痰瘀毒相關(guān)論[J].山東中醫(yī)雜志，2000，19(6)：323.

[6]Tailleux A，Duriez P，F(xiàn)ruchart JC，et al.Apolipoprotein A-Ⅱ，HDL metabolism and atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2002，164(1)：1-13.

[7]吳勇.黃芪多糖對糖尿病大鼠微血管病變的作用及機(jī)制的研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2001，9(3)：16.

[8]鄭杭生，馮年平，陳佳，等.乳香沒藥的提取工藝及其提取物的鎮(zhèn)痛作用[J].中成藥，2004，26(11)：956-958.

[9]Anwar A，Zahid AA，Scheidgegger KJ，et al.Tumor necrosis factor alpha regulates insulin-like growth factor-1 and insulin-like growth factor-3 expression in vascular smooth muscle[J].Circulation，2002，105：1220-1225.

[10]Schwartz SM， Hatsukami TS，Yuan C.Molecular markers，fibrous cap rupture，and the vulnerable plaque new experimental opportunities[J].Circ Res，2001，89(6)：471-473.

(本文編輯郭懷印)

Effects of Qijie Rumo Capsule on Blood Lipid and Inflammatory Response in Apolipoprotein E-knockout Mice

Shi Qi，Hu Yuanhui，Li Youlin，Wu Huaqin，Chu Yuguang，Qi Lianfen

China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China

Corresponding Author：Hu Yuanhui(Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Qijie Rumo capsule(QRC) on blood lipid and inflammatory response in apolipoprotein E-knockout (ApoE-/-) mice.MethodsEight weeks old ApoE-/- mice were fed with high-fat diet and after 30 days continuous intragastric administration，detected lipids by enzymic and selective precipitation methods.Meanwhile，the aortas and hearts tissue were taken for immunohistochemistry stain in order to measure the expression of tumor necrosis factor (TNF)-α in aortal intima and plaque.ResultsThe levels of total cholesterol(TC)，triglyceride(TG) and low density lipoprotein (LDL-C) in QRC high- and low-dose groups were lower than that in model group(P<0.05 or P<0.01).The immunohistochemistry stain shows that compared with model group，the expression of TNF-α in QRC groups had reduced by different degree (P<0.05 or P<0.01).ConclusionQRC can reduce the lipid levels，restrain the expression of TNF-α in ApoE-/- mice.It can relieve the atherosclerosis (AS) lesions by the means of inhibiting the produce of inflammatory factors.

Key words：atherosclerosis；apolipoprotein E-knockout mice；Qijie Rumo capsule；blood lipid；inflammatory response

(收稿日期：2015-08-05)

通訊作者：胡元會， E-mail：huiyuhui@yahoo.com.cn

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．009

文章編號：1672-1349(2015)18-2057-03

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·