蘭　勇, 程　帆

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科, 湖北 武漢, 430060)

華蟾素對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響

蘭勇, 程帆

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院 泌尿外科, 湖北 武漢, 430060)

摘要:目的探討華蟾素對(duì)人腎癌786-0細(xì)胞的影響及機(jī)制。方法用不同濃度的華蟾素(濃度分別為1、10、100、1 000 μg/mL)作用于人腎癌786-0細(xì)胞株,采用CCK-8法檢測(cè)華蟾素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)華蟾素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞周期的影響,采用蛋白印跡法檢測(cè)華蟾素對(duì)Survivin蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果CCK-8法結(jié)果提示,不同濃度的華蟾素均可顯著抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖，且抑制率呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)華蟾素可使腎癌786-0細(xì)胞周期中的G0/G1期比例增加，S期縮短。蛋白印跡法顯示，華蟾素可使腎癌786-0細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá)水平降低。結(jié)論華蟾素能夠抑制人腎癌786-0細(xì)胞的增殖，并阻滯細(xì)胞周期在G0/G1期，其機(jī)制可能與影響蛋白Survivin的表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞:華蟾素; 人腎癌786-0細(xì)胞; 細(xì)胞增殖; Survivin

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)3大常見(jiàn)腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類的生命以及健康。近年來(lái)，腎癌的發(fā)病率、死亡率呈逐漸上升的趨勢(shì)，而治療手段主要采取手術(shù)切除治療，以及輔以內(nèi)分泌等治療，均取得較好的療效。對(duì)于晚期腎癌、轉(zhuǎn)移腎癌的治療效果仍然不是很滿意，故尋求新的抗腫瘤途徑極為重要[1]。隨著對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的研究發(fā)現(xiàn)，中藥在抗腫瘤方面顯示出獨(dú)特的作用，中藥抗腫瘤的研究亦越來(lái)越受到重視，其中華蟾素[2-3]是研究較多的傳統(tǒng)中藥之一，其具有止痛、消炎作用。最近研究發(fā)現(xiàn)其還具有抗腫瘤作用，且動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示未見(jiàn)明顯的毒副作用。本研究探討華蟾素在體外對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與試劑

1.1　材料與設(shè)備

人腎癌786-0細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心。細(xì)胞用含10%小牛血清、100 μ/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。華蟾素購(gòu)自安徽淮北金蟾藥業(yè)公司，于-4 ℃保存，使用前用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

RPMI 1640干粉培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)小牛血清均為GIBCO公司產(chǎn)品; CCK-8、DMSO為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡NIKON TE2000為上海衡橋儀器有限公司產(chǎn)品；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為Thermo公司產(chǎn)品, 流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼公司產(chǎn)品。胰蛋白酶凍干粉，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)買自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Nuaire公司，微量移液器購(gòu)自法國(guó)Gilson公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司，干燥箱購(gòu)自上海市實(shí)驗(yàn)儀器總，冰箱購(gòu)自西門子公司，細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)買自IWAKI公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1CCK-8法檢測(cè)華蟾素對(duì)786-0細(xì)胞增殖的影響：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌786-0細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞密度后接種于96孔培養(yǎng)板中，200 μL/孔，其分組為:凋零孔組(只含RPMI 1640培養(yǎng)液,無(wú)細(xì)胞)、對(duì)照組(含RPMI 1640培養(yǎng)液、細(xì)胞)、華蟾素組(華蟾素濃度分別為1、10、100、1 000 μg/mL), 接種待細(xì)胞貼壁后加藥，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，各組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后棄上清，加入CCK-8(5 mg/mL) 20 μL/孔，繼續(xù)培育4 h, 加入 DMSO 200 μL/孔，振蕩使其溶解。用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm處各孔的吸光度(OD)值，按以下公式計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率：抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)華蟾素對(duì)786-0細(xì)胞周期的影響：取生長(zhǎng)良好的腎癌786-0細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞后,用PBS液清洗、離心后，重新接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中, 對(duì)照組中加入等體積培養(yǎng)液，藥物組中加入華蟾素,使其濃度分別為1、10、100、1000 μg/mL, 于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，用固定液固定細(xì)胞過(guò)夜后，離心5 min棄上清，用PBS洗滌，用含0.1% Triton X-100和50 μg/mL RNAse的PBS混合液重懸細(xì)胞，加入90 μL PI(0.5 mg/mL)避光孵育0.5 h, 經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.3蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)華蟾素對(duì)Survivin蛋白的影響:實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、華蟾素藥物組(其濃度分別為100、1 000 μg/mL); 待傳代細(xì)胞貼壁后加入藥物，對(duì)照組種加入相應(yīng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，于48 h收集細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入100 μL細(xì)胞裂解液，于冰上裂解40 min, 用細(xì)胞刷子刮下各組細(xì)胞，分別收集于細(xì)胞試管中并貼上標(biāo)簽，于4 ℃進(jìn)行12 000 r/min離心5 min后取上清液，并測(cè)定蛋白濃度,計(jì)算樣本上樣量,進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜，膜用含5%脫脂奶粉的TBST于4 ℃恒溫冰柜中搖床、封閉過(guò)夜，第2天去封閉液，用TBST洗膜3～4次，每次5 min, 加入鼠抗人Survivin抗體(1∶2 000),室溫下?lián)u床孵育2 h, TBST洗膜3次，每次5 min, 然后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶2 000)，繼續(xù)搖床孵育2 h，TBST洗膜3次后(5 min/次)加入化學(xué)底物發(fā)光液A、B液，于暗室中進(jìn)行顯影、定影、掃描。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不同時(shí)間、不同濃度行重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　華蟾素抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖

通過(guò)CCK-8法實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為1、10、100、1 000 μg/mL的華蟾素作用于腎癌786-0細(xì)胞24、48、72 h后，腎癌786-0細(xì)胞的增殖顯著變緩，且隨著華蟾素藥物濃度的增加、處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用具有增強(qiáng)趨勢(shì)，具有時(shí)間、劑量依賴關(guān)系，藥物組對(duì)腎癌細(xì)胞的抑制率與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1　不同濃度的華蟾素對(duì)786-0細(xì)胞增殖的影響(n=9)

與對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.2　華蟾素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞周期的影響

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)濃度為1、10、100、1 000 μg/mL的華蟾素作用于腎癌786-0細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比較，華蟾素各濃度組G0/G1期所占比例較對(duì)照組增加，而S期細(xì)胞比例較對(duì)照組減少，而G2/M期無(wú)顯著變化，提示華蟾素能夠使腎癌786-0細(xì)胞生長(zhǎng)周期主要阻滯在G0/G1期，從而抑制腎癌細(xì)胞的增殖,各濃度藥物組與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2　華蟾素對(duì)786-0細(xì)胞周期的影響(n=3)

與對(duì)照組比較，*P<0.05, **P<0.01。

A. 對(duì)照組; B. 華蟾素濃度為1 μg/mL; C. 華蟾素濃度為10 μg/mL; D. 華蟾素濃度為100 μg/mL; E. 華蟾素濃度為1 000 μg/mL。

圖1華蟾素對(duì)腎癌細(xì)胞786-0細(xì)胞周期的影響

2.3　華蟾素抑制Survivin蛋白的表達(dá)

通過(guò)Western印跡法實(shí)驗(yàn)顯示，濃度為100、1 000 μg/mL的華蟾素作用于腎癌細(xì)胞48 h后，藥物組中Survivin蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較逐漸下降，進(jìn)行灰度分析，發(fā)現(xiàn)藥物組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2-3。

a. 對(duì)照組; b. 華蟾素100 μg/mL; c. 華蟾素1 000 μg/mL

與對(duì)照組比較，*P<0.05, **P<0.01;

與100 μg/mL華蟾素組比較，△P<0.05

圖3灰度分析華蟾素對(duì)腎癌細(xì)胞中Survivin蛋白

表達(dá)水平的影響

3討論

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率以及死亡率均有一定的提升，其發(fā)病原因未明，而其治療方案仍然以手術(shù)為主，但對(duì)于晚期腫瘤、轉(zhuǎn)移腫瘤目前仍然無(wú)有效的治療手段。因此，醫(yī)學(xué)專家仍然為腎癌的進(jìn)一步治療尋找著新的治療策略。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)中醫(yī)藥材逐漸成為當(dāng)今治療腫瘤的重要手段以及新的策略之一，中藥材的優(yōu)勢(shì)主要在于其不僅對(duì)腫瘤具有顯著的抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)機(jī)體的損傷以及副作用小。因此，研究中藥材抗腫瘤效應(yīng)具有廣闊的臨床應(yīng)用價(jià)值。

華蟾素系傳統(tǒng)中藥中華大蟾蜍皮的水制劑，其主要成分是蟾毒靈及吲哚生物堿等，具有消炎、止痛、抗腫瘤以及提高宿主免疫力等多種作用[4]，已列為國(guó)家級(jí)中藥保護(hù)品種。近年來(lái)有研究[5-7]表明，華蟾素對(duì)多種腫瘤如乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用并可誘導(dǎo)其凋亡。且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]顯示華蟾素具有升白細(xì)胞的作用，具有安全有效、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的輔助治療。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的華蟾素作用于腎癌786-0細(xì)胞后，通過(guò)CCK-8法觀察發(fā)現(xiàn)，華蟾素可顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，且對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng)，這說(shuō)明華蟾素對(duì)786-0細(xì)胞的抑制效應(yīng)具有一定的量效、時(shí)效性，表明華蟾素可顯著抑制786-0細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的華蟾素作用于腎癌786-0細(xì)胞48 h后，華蟾素各濃度組將細(xì)胞周期主要阻滯在G0/G1期，使細(xì)胞S期所占比例明顯減少，提示華蟾素可通過(guò)將786-0細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖[9-11]。

細(xì)胞凋亡與許多生物學(xué)過(guò)程以及疾病的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)，是維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、自身組織穩(wěn)定的重要生命現(xiàn)象。當(dāng)衰老細(xì)胞不能通過(guò)凋亡機(jī)制予以清除時(shí)，便可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12-14]。Survivin基因也是IAPs家族的重要成員，Survivin基因通過(guò)抑制凋亡核心半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)-3和Caspase-7, 影響后者在細(xì)胞內(nèi)微管的聚合、解聚，阻斷細(xì)胞周期G2/M期，抑制細(xì)胞凋亡，它還參與腫瘤血管形成。因此，Survivin基因也參與了腫瘤的發(fā)生與演變。本課題用不同濃度的華蟾素作用于腎癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Survivin蛋白的表達(dá)隨著藥物濃度的增加而下降。

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Influence of cinobufotalin on proliferation of renal cancer cells

LAN Yong, CHENG Fan

(DepartmentofUrinarySurgery,ThePeople′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei, 430060)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence and mechanism of cinobufotalin on the proliferation of human renal cancer cell lines 786-0. MethodsHuman renal cancer cell lines 786-0 were processed with different concentrations of cinobufotalin (concentrations were 1, 10, 100, 1 000 μg/mL). Influence of cinobufotalin on cell proliferation of renal cancer cell lines 786-0 was examined by CCK-8, and influence on cell cycle was detected by flow cytometry (FCM). Influence of cinobufotalin on expression level of Survivin protein was detected by Western blotting.ResultsThe CCK-8 showed that different concentrations of cinobufotalin significantly inhibited proliferation of renal cancer cell lines 786-0, and the inhibitory rate was correlated with time and dose. FCM test showed that cinobufotalin was able to increase the proportion of the cell cycle in the G0/G1phase and shorten S phase in renal cancer cell lines 786-0. Western blotting showed that cinobufotalin was able to reduce expression level of Survivin protein in renal cancer cell lines 786-0. ConclusionCinobufotalin can inhibit proliferation of cells and block the cell cycle in the G0/G1phase in renal cancer cell lines 786-0, and its mechanism is probably correlated with the influence of expression of Survivin protein.

KEYWORDS:cinobufotalin; renal cancer cell lines 786-0; cell proliferation; Survivin

通信作者:程帆, E-mail:415827@qq.com

收稿日期:2015-01-20

中圖分類號(hào):R 692

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2015)07-083-04DOI: 10.7619/jcmp.201507024