周晨晨，胡 琦，侯文沛

(上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

綜 述

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞缺陷與再生障礙性貧血的研究進展

周晨晨，胡 琦，侯文沛

(上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

再生障礙性貧血；調(diào)節(jié)性T細胞；Foxp3；遷徙

再生障礙性貧血(aplasticanemia，AA)是一種骨髓造血衰竭綜合征，以骨髓造血細胞增生減低和外周血全血細胞減少為特征，其實質(zhì)是以骨髓組織為靶器官，T細胞免疫異常介導的自身免疫性疾病。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryTcell，Treg)是體內(nèi)一類特殊的輔助性T細胞亞群，該群細胞具有維持免疫耐受和防止自身免疫病的作用[1]。近年來大量研究證明Treg細胞缺陷與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展相關，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞缺陷包括細胞數(shù)量的減少、表達降低以及細胞功能障礙，本文就該細胞的缺陷與AA關系的作一綜述。

1 Treg細胞數(shù)量與AA

在健康人中，CD4+CD25+Treg細胞約占外周血CD4+T細胞的5%～10%[2-3]。根據(jù)其起源的不同，可將Treg細胞可分為胸腺來源的天然性調(diào)節(jié)性T細胞(nature Treg，nTreg)和外周誘導的獲得性調(diào)節(jié)性T細胞(inducible Treg，iTreg)，其中nTreg在參與預防異常自身免疫反應中起主要作用。Treg細胞主要通過細胞間接觸途徑殺傷細胞毒性細胞，抑制細胞毒性細胞產(chǎn)生白細胞介素-2(IL-2)等細胞因子，以及分泌抑制性細胞因子IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)這三種途徑發(fā)揮免疫耐受和免疫抑制作用[4]。

Solomou等[5]首次發(fā)現(xiàn)，確診再障的患者外周血單個核細胞中Treg細胞數(shù)量減低；其中7例接受免疫抑制治療后出現(xiàn)造血應答的患者中，有6例的Treg細胞數(shù)量和Foxp3表達水平相對未治療前均輕微升高；而3例接受免疫抑制治療達到完全緩解(CR)的患者，Treg細胞數(shù)量較治療前增加。國內(nèi)王西閣等[6]研究也發(fā)現(xiàn)，急慢性AA患兒Treg細胞百分均低于對照組，與Solomou研究結果一至，且在SAA中Treg細胞比例進一步降低。

初始CD4+T細胞在不同的細胞因子及環(huán)境作用下可發(fā)育為功能及表型不同的輔助T細胞，如Th1細胞、Th2細胞、Treg、Th17以及濾泡輔助T細胞、Th9、Th22等[7]。其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與Th17細胞關系較密切，它們功能拮抗、相互制約，共同維持機體的免疫內(nèi)穩(wěn)態(tài)。de Lator等[8]研究發(fā)現(xiàn)，AA患者Th17與Treg呈負相關。 線性回歸模型分析顯示，與對照相比AA患者骨髓及外周血中Th17比例增加而Treg比例較少；CR患者外周血中Th17比例較確診時減少，而Treg比例增加；部分緩解(PR)患者較CR患者相比差異較小，但仍有顯著差異。

2 Treg細胞表達與AA

Treg的表面分子B細胞內(nèi)分子與其穩(wěn)定和功能的發(fā)揮相關，Treg細胞主要表達白細胞介素-2受體的α鏈(CD25)、轉錄因子Foxp3、細胞毒性T淋巴抗原4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關蛋白(GITR)等[9]。Foxp3分子在Treg上表達具有特異性，是目前被認為Treg最具有特征性的分子標志，是控制Treg的發(fā)育、表型和功能維持的主要調(diào)控基因[9-10]。Foxp3是轉錄因子叉頭樣/翼狀螺旋(forhead/winged-helix)家族成員，其編碼基因位于X染色體，在Tregs細胞維持免疫耐中受起重要作用。在小鼠體內(nèi)，F(xiàn)oxp3基因的突變會導致嚴重的淋巴組織增生、淋巴細胞浸潤的多組織自身免疫性反應，這種小鼠即為Scurf小鼠[11]。而在人類基因組中，F(xiàn)oxp3轉錄突變將會導致一種罕見的X連鎖免疫多內(nèi)分泌腺病腸病綜合征(immunedysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X-linked syndrom，IPEX)[12]。阻斷正常來源的Tregs細胞的Foxp3表達，其免疫抑制功能將下降。

活化T細胞核因子(NFAT)是T細胞受體(TCR)介導的信號轉導通路中關鍵的轉錄因子，NFAT家族成員主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4。Foxp3基因與NFAT具有許多相同的目標基因，轉錄因子NFAT1可通過與Foxp3的啟動子結合形成Foxp3/NFAT/DNA復合物，從而促進Foxp3的表達[13]。Solomou等[5]發(fā)現(xiàn)，再障患者Foxp3 mRNA、蛋白水平也是顯著降低的，同時伴隨NFAT1蛋白水平的降低，而NFAT1蛋白水平的降低可以解釋Foxp3表達的下降和Treg頻率的降低[13]。王西閣等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SAA組的Foxp3 mRNA表達水平明顯低于對照組和NSAA組；相關性分析顯示，SAA組Treg細胞數(shù)量與Foxp3 mRNA表達呈正相關。該研究提示在AA的免疫發(fā)病機制中可能存在Foxp3 mRNA的表達水平下降，從而導致Treg的免疫抑制功能不能正常發(fā)揮。

序列分析顯示，F(xiàn)oxp3分子存在三個高度保守的位點：啟動子、TGF-β敏感區(qū)和特異性去甲基化區(qū)(TSDR)[14]。Treg細胞Foxp3的啟動子與TSDR的CpG基序幾乎完全處于去甲基化狀態(tài)，F(xiàn)oxp3分子CpG基序的甲基化能夠阻止轉錄因子與其結合，或者招募抑制基因轉錄的分子，從而抑制Foxp3轉錄。Foxp3分子的轉錄沉默與相應調(diào)節(jié)區(qū)的甲基化相關，從而影響Treg細胞的數(shù)量，導致多種免疫性疾病的發(fā)生。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性硬化癥中Foxp3分子甲基化水平增高，而Foxp3 mRNA水平降低，Treg細胞數(shù)量減少；用甲基化抑制因子5氮雜胞苷處理CD4+T細胞后，F(xiàn)oxp3甲基化水平降低，F(xiàn)oxp3 mRNA增加，Treg細胞數(shù)量增多；Foxp3啟動子的甲基化水平與Foxp3分子的表達、疾病的嚴重程度相關，F(xiàn)oxp3啟動子的甲基化導致Foxp3表達降低以及Treg細胞數(shù)量減少與系統(tǒng)性硬化癥的免疫紊亂相關。國內(nèi)也有關于Foxp3甲基化與原發(fā)性干燥綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫糖尿病、類風濕性關節(jié)炎等免疫性疾病的相關研究。

3 Treg細胞功能障礙與AA

Treg細胞調(diào)控效應T細胞的機制是通過細胞間接觸途徑，因此Treg功能的正常發(fā)揮依賴于Treg遷徙至相應組織與微環(huán)境的能力。AA中骨髓作為效應T細胞的主要靶器官，因而Treg的骨髓遷徙能力在對效應T細胞的免疫抑制中起關鍵作用[16]。骨髓是Treg細胞重要的儲存池，Treg通過基質(zhì)細胞衍生因子-1α/趨化因子受體CXCR4通路即SDF-1α/CXCR4信號通路遷徙至骨髓[17]，其中CXCR4是Treg細胞遷徙至骨髓的特異性受體，而SDF-1α是目前唯一已知的Treg骨髓遷移趨化因子[18]。Shi等[19]研究發(fā)現(xiàn)AA患者外周血Treg遷徙能力，較正常對照組明顯減低，并且SAA患者Treg遷徙力低于NSAA患者，表明Treg細胞遷徙能力的受損與AA的嚴重程度相關。與健康對照組相比，AA患者外周血Treg細胞趨化因子受體CXCR4 mRNA的表達水平明顯降低，且SAA患者CXCR4 mRNA的表達水平低于NSAA患者，這與Treg細胞的遷徙能力相一致。同時通過ELISA檢測正常對照組、SAA組、NSAA組3組血清SDF-1α，結果3組血清SDF-1α水平比較差異無統(tǒng)計學意義。因而，再障患者Treg細胞遷徙能力的受損，可能是由于Treg細胞趨化因子受體CXCR4表達下降，而并非是SDF-1α分泌不足對造血微環(huán)境的影響所造成的。

Shi等[19]將骨髓與所造成的外周血的Treg細胞、CD4+CD25-效應T細胞 (Tresp)、CD8+細胞毒性T細胞(Tcyt) 分離，并進行交叉共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)AA患者外周血與骨髓Treg細胞抑制Tresp細胞、Tcyt細胞的能力均較對照組減低。交叉共培養(yǎng)實驗顯示，AA患者Treg細胞抑制對照組Tresp與Tcyt能力較低，而對照組Treg細胞對自身Tresp與Tcyt有較強的抑制力。結果表明，AA患者Treg細胞對自體效應性T細胞的免疫抑制能力受損，而健康者Treg細胞具有抑制效應性T細胞過度反應的能力。因而認為AA患者Treg細胞存在免疫抑制功能缺陷。

干擾素-γ(IFN-γ)是Th1免疫應答中重要的抑制性細胞因子，通過對CD34+造血干細胞的直接毒性作用從而損傷造血功能[20]。Shi等[19]通過細胞共培養(yǎng)并檢測IFN-γ含量，體外實驗顯示AA患者Treg細胞抑制Th1產(chǎn)生造血負調(diào)控因子的能力降低。同時AA患者Treg及效應T細胞與造血細胞集落體外培養(yǎng)，結果顯示AA組粒-單核細胞集落形成單位(colony forming unit-granulocyte monocyte，CFU-GM)、暴增性紅細胞集落形成單位(burst forming unit-erythroid，BFU-E)、混合集落形成單位(colony forming unit-mix，CFU-mix)明顯小于對照組。體外實驗可表明，AA患者Treg細胞的免疫抑制缺陷造成造血功能受損。已有體外實驗顯示，抗胸腺細胞球蛋白(Anti-Tlymphocyte globulin，ATG)可以提高Treg細胞數(shù)量及功能[21]，因此可以推斷增強Treg細胞的免疫抑制功能可以減輕AA造血損傷，促進造血功能恢復。

4 結 語

隨著對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的免疫調(diào)節(jié)機制的深入研究，將有助于闡明AA的發(fā)病機制。AA的發(fā)生不僅與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量下降、表達水平降低有關，還與Treg的骨髓遷移能力、免疫抑制功能的缺陷相關。通過修復與糾正Treg細胞數(shù)量與功能的變化，有助于重建免疫穩(wěn)態(tài)，Treg相關免疫治療提供了AA的一種新免疫治療方向。

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2014-08-30