李 偉

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

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睪酮凝膠微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)的研究

李 偉

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的：建立睪酮凝膠微生物限度檢查方法，并進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。方法：利用5%氯化鈣溶液能與睪酮凝膠中的主要基質(zhì)卡波姆結(jié)合形成鈣鹽沉淀達(dá)到破膠目的的原理，取本品10 g，加5%無(wú)菌氯化鈣溶液30 ml，振搖，使凝膠基質(zhì)破膠產(chǎn)生沉淀，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，自然沉降5 min，取上部溶液進(jìn)行薄膜過(guò)濾，沖洗后，取濾膜依法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)及控制菌檢查。結(jié)果：可有效去除睪酮凝膠的抑菌作用，使各試驗(yàn)菌的加菌回收率均符合《中國(guó)藥典》要求。結(jié)論：本方法用于睪酮凝膠的微生物限度檢查，方法可行，準(zhǔn)確可靠。

睪酮凝膠，微生物限度檢查，方法適用性試驗(yàn)

睪酮凝膠為睪酮缺乏癥的替代治療藥，用于因睪酮缺乏而引起的男性性腺功能不足癥的替代治療。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版通則(草案)“1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法”和“1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”的有關(guān)規(guī)定，在建立睪酮凝膠微生物限度檢查方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)該品種有較強(qiáng)的抑菌作用，采用培養(yǎng)基稀釋法不能消除其抑菌作用。由于本品為凝膠劑，取常規(guī)法制成的1∶10供試液無(wú)法通過(guò)薄膜過(guò)濾法消除其抑菌作用。本方法利用氯化鈣與卡波姆中的丙烯酸交聯(lián)聚合物結(jié)合形成鈣鹽沉淀的原理，從而達(dá)到破膠的目的，自然沉降去除沉淀物后，上部溶液可以順利通過(guò)微孔濾膜，經(jīng)沖洗后，可有效去除睪酮凝膠的抑菌作用，使各試驗(yàn)菌的加菌回收率均達(dá)到滿意的效果[1]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 MLS-378IL壓力蒸汽滅菌器(松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社)，SG-403生物安全柜(美國(guó)baker公司)，ADS161SMU 超凈工作臺(tái)(日本Yamato株式會(huì)社)，SANYO MIR-254恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋株式會(huì)社)，SANYO MIR-554恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋株式會(huì)社)，Whatman 薄膜過(guò)濾器(英國(guó)沃特曼公司)。

1.2 培養(yǎng)基及稀釋劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20140106)，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)20140901)，胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)20140409)，以上培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)140401)，甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)140124)，pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號(hào)1404112)，上述培養(yǎng)基及稀釋劑均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。以上市售脫水培養(yǎng)基為本試驗(yàn)按標(biāo)簽說(shuō)明配制并高壓滅菌后備用。

1.3 試劑 無(wú)水氯化鈣(批號(hào)20140112)、氯化鈉(批號(hào)20140228)，以上試劑均為分析純，均購(gòu)自天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠。

1.4 菌種 金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus,CMCC (B)26003]，枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis,CMCC(B)63501]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa,CMCC(B)10104]，白色念珠菌[Candida albicans,CMCC (F) 98001]，黑曲霉[Aspergillus niger,CMCC (F)98003]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.5 樣品 睪酮凝膠(臺(tái)灣友華生技醫(yī)藥股份有限公司提供，規(guī)格50 mg：1%，批號(hào)80181A、80188E、80182A)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 陽(yáng)性對(duì)照菌液的制備

2.1.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)18 h；取上述培養(yǎng)物分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液以10倍遞增法稀釋制成每1 ml含菌數(shù)約為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.1.2 白色念珠菌菌液的制備 取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，接種至沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h；取上述培養(yǎng)物分別用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液以10倍遞增法稀釋制成每1 ml含菌數(shù)約為50～100 cfu的菌懸液。

2.1.1.3 黑曲霉菌液的制備 取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5～7 d后，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5 ml將孢子洗脫，然后用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液以10倍遞增法稀釋制成每1 ml含孢子數(shù)約為50～100 cfu的孢子懸液。

2.1.2 供試液的制備

2.1.2.1 常規(guī)平皿法 取供試品10 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，混勻，作為1∶10供試液(A供試液)。

2.1.2.2 培養(yǎng)基稀釋法 取供試品10 g，加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至500 ml，混勻，作為1∶50供試液(B供試液)。每1 ml中供試品含量相當(dāng)于1∶10供試液0.2 ml中的供試品含量。

2.1.2.3 薄膜過(guò)濾法 取本品10 g，加5%無(wú)菌氯化鈣溶液30 ml，振搖，使產(chǎn)生沉淀(破膠)，再加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，混勻，自然沉淀5 min后，取上部溶液作為1∶10破膠供試液(C供試液)。

2.2 菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證

2.2.1 常規(guī)平皿法和培養(yǎng)基稀釋法

2.2.1.1 試驗(yàn)組 取A供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量與菌液組(50～100 cfu/ml)濃度一致的供試液，取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供試液，各取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。再分別取白色念珠菌和黑曲霉的供試液1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。含每種菌的供試液各平行制備2個(gè)平皿，試驗(yàn)重復(fù)3次。取B供試液9.9 ml，按A供試液同法操作。

2.2.1.2 菌液組 取適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液加pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至10 ml，混勻，制成菌含量50～100 cfu/ml的菌懸液，吸取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。同法制備含枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液，各取1 ml至平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基。再分別取白色念珠菌和黑曲霉的菌懸液1 ml至平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種菌懸液各平行制備2個(gè)平皿。

2.2.2.3 供試品對(duì)照組 取A供試液1 ml至平皿中，立即傾注相應(yīng)培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。取B供試液1 ml，按A供試液同法操作。

2.2.2.4 結(jié)果 常規(guī)平皿法3次平行試驗(yàn)，5種菌在兩種不同培養(yǎng)基上均受抑制，回收率均為0。而培養(yǎng)基稀釋法3次平行試驗(yàn)，5種菌在兩種不同培養(yǎng)基上的回收率均小于50%。說(shuō)明此兩種方法無(wú)法有效檢測(cè)睪酮凝膠中的微生物含量，必須重新建立新的菌落計(jì)數(shù)的驗(yàn)證方法。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

2.2.2 薄膜過(guò)濾法

2.2.2.1 試驗(yàn)組 取C供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量與菌液組(50～100 cfu/ml)濃度一致的供試液，取1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。同法制備含枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的供試液，各取1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，取膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上。再分別取白色念珠菌和黑曲霉的供試液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，取膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上。

表1 常規(guī)平皿法回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

表2 培養(yǎng)基稀釋法回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.2.2.2 菌液組 依“2.2.1.2”項(xiàng)下方法操作。

2.2.2.3 供試品對(duì)照組 按試驗(yàn)組的方法和條件測(cè)定供試品本底菌落數(shù)。

2.2.2.4 結(jié)果 通過(guò)3次平行試驗(yàn)，5種菌在兩種不同培養(yǎng)基上的回收率均大于50%。說(shuō)明本方法先用氯化鈣溶液與凝膠基質(zhì)中的卡波姆結(jié)合形成沉淀達(dá)到破膠的目的，取上部溶液薄膜過(guò)濾，經(jīng)沖洗液沖洗，能充分去除本品中的抗(抑)菌成分，可以用于睪酮凝膠中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 薄膜過(guò)濾法回收率測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1 金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.1.1 試驗(yàn)組 取C供試液10 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)，取濾膜加入100 ml胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3.1.2 陽(yáng)性對(duì)照組 取規(guī)定量的金黃色葡萄球菌(約50～100 cfu)加入100 ml胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的培養(yǎng)基均渾濁，取上述培養(yǎng)物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h，均可見(jiàn)金黃色菌落，外周有黃色環(huán)，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤(rùn)。取平板上典型菌落，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行血漿凝固酶鑒定實(shí)驗(yàn)，確證為金黃色葡萄球菌。

2.3.1.3 驗(yàn)證結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照組檢出金黃色葡萄球菌；試驗(yàn)組檢出金黃色葡萄球菌；適用性試驗(yàn)結(jié)果符合要求。

2.3.2 銅綠假單胞菌檢查方法的驗(yàn)證

2.3.2.1 試驗(yàn)組 取C供試液10 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量銅綠假單胞菌(約50～100 cfu)，取濾膜加入100 ml胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。

2.3.2.2 陽(yáng)性對(duì)照組 取規(guī)定量的銅綠假單胞菌(約50～100 cfu)加入100 ml胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基中， 35 ℃培養(yǎng)24 h。

試驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的培養(yǎng)基均渾濁，取上述培養(yǎng)物劃線接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，35 ℃培養(yǎng)24 h，均可見(jiàn)灰白色菌落，扁平、無(wú)定型、表面濕潤(rùn)，菌落周圍有藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散，經(jīng)分離、純化后進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和綠膿菌素的鑒定試驗(yàn)，確證為銅綠假單胞菌。

2.3.2.3 驗(yàn)證結(jié)果 陽(yáng)性對(duì)照組檢出銅綠假單胞菌；試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌；適用性試驗(yàn)結(jié)果符合要求。證明睪酮凝膠的控制菌檢查可以采用上述方法進(jìn)行。

3 討論

3.1 由于睪酮凝膠的主要基質(zhì)是卡波姆，在制備過(guò)程中使用乙醇為溶劑，使卡波姆溶脹交聯(lián)而形成凝膠，造成本品比較黏稠，常規(guī)法制備的供試液無(wú)法順利通過(guò)微孔濾膜，因此利用氯化鈣與卡波姆中的丙烯酸交聯(lián)聚合物結(jié)合形成鈣鹽沉淀的原理，從而達(dá)到使凝膠基質(zhì)破膠的目的。

3.2 與《中國(guó)藥典》2010年版相比，《中國(guó)藥典》2015年版通則(草案)在微生物限度檢查項(xiàng)下有較大的變動(dòng)。培養(yǎng)基體系參照歐洲藥典，檢驗(yàn)項(xiàng)目由檢查細(xì)菌數(shù)改為檢查需氧菌總數(shù)。計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證中取消了稀釋劑對(duì)照組，試驗(yàn)組加陽(yáng)性菌的順序由在最后加入平皿中改為從稱取樣品時(shí)就加入，充分模擬樣品染菌的狀態(tài)，從而使驗(yàn)證方法更加客觀真實(shí)。

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)表明，睪酮凝膠的微生物限度檢查方法為：取本品10 g，加5%無(wú)菌氯化鈣溶液30 ml，振搖，使產(chǎn)生沉淀，再加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，混勻，自然沉降5 min，作為1∶10供試液。分別取1∶10供試液1 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，取濾膜分別依法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查；取1∶10供試液10 ml薄膜過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液300 ml分次沖洗，取濾膜分別依法進(jìn)行銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌檢查。

1 中國(guó)藥典[S].二部.2010:附錄107-116

2015-05-02

R927.1

A

1006-5687(2015)04-0024-03