申 琳，曲 佳

(1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150； 2.天津市藥品檢驗所，天津 300070)

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HPLC法測定通絡(luò)片中黃芩苷的含量及TLC研究

申 琳1，曲 佳2

(1.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300150； 2.天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立HPLC法測定通絡(luò)片中黃芩苷的含量，TLC法定性鑒別血竭、黃芩。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.2)；流速：1.0 ml/min；檢驗波長：277 nm。結(jié)果：黃芩苷進樣濃度在0.001 76～0.035 20 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，平均回收率為99.24%，RSD為0.57%(n=6)；薄層色譜鑒別清晰，陰性無干擾。結(jié)論：建立的方法簡易，穩(wěn)定性及專屬性強，且具有良好的重復性，可用于通絡(luò)片的質(zhì)量控制。

通絡(luò)片，黃芩苷，HPLC，血竭

通絡(luò)片由血竭、黃芩、蘄蛇等多味藥材精制而成，具有活血通絡(luò)、降壓降脂、清熱解毒之功，臨床用于偏癱、四肢不利、言語蹇澀等癥，并具有降壓降脂之功。方中黃芩具有清熱燥濕、降血壓、降血脂、保肝利膽的藥理作用[1]。為更好地控制品種質(zhì)量標準，特采用HPLC法測定黃芩苷含量，TLC法定性黃芩和血竭，為控制該制劑質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津液相色譜儀(LC-10ATUP/SPD-10AVP，島津儀器公司)，色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，電子分析天平(AP1140，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司)，超聲波清洗器(AS10200BT，天津奧特塞恩斯儀器有限公司)，高速萬能粉碎機(FW100，天津市泰斯特儀器有限公司)；黃芩苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號110715-200514)；無水甲醇(色譜純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；其余試劑為分析純；純凈水(杭州娃哈哈)；通絡(luò)片(天津醫(yī)科大學在研樣品，規(guī)格0.6 g/片，批號20140826、20140910、20140928)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(250 mm×4.8 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.2)，流速：1.0 ml/min，柱溫：30 ℃。檢驗波長：277 nm；進樣量：10 μl，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計不低于2 500；分離度大于2.0[2-4]。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對照品溶液制備 精密稱取黃芩苷對照品，加甲醇制成黃芩苷對照品溶液(0.017 6 mg/ml)。

2.1.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，用高速萬能粉碎機進行粉碎，精密稱定粉末1 g，置于50 ml量瓶中，加入60%甲醇約45 ml，超聲處理50 min，取出放冷，加60%甲醇至刻度，搖勻，以微孔濾膜過濾，濾液為供試品溶液。

2.1.2.3 陰性對照液制備 取除黃芩以外藥材，制成陰性樣品，按供試品溶液方法制成陰性對照溶液。將上述溶液各10 μl分別注入液相色譜儀，色譜圖結(jié)果見圖1，陰性對照品無干擾。

1.黃芩苷

2.1.3 線性關(guān)系考查 精密吸取黃芩苷對照品溶液0.001 76、0.008 80、0.017 60、0.026 40和0.035 20 mg/ml 各10 μl注入液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，以濃度(mg/ml)對峰面積繪制標準曲線，標準曲線方程：Y=1.735 4×106X-6.149 3×105(r=0.999 5)。結(jié)果黃芩苷對照品在0.001 76～0.035 20 mg/ml范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 重復性試驗 取同一批號(20140826)樣品6份，按“2.1.2.2”方法項下制成供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件測定，測得樣品溶液中黃芩苷平均含量為1.780 mg/g，RSD為1.23%，表明該方法具有良好的重復性。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.4”項下一份供試品溶液，放置室溫，精密吸取10 μl，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、3、6、9、12和24 h進樣，共6次，測得峰面積RSD為0.35%。結(jié)果表明：以本試驗方法制成的供試品溶液在室溫下24 h穩(wěn)定。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取“2.1.4”項下一份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測峰面積，得RSD為1.55%，證明試驗儀器具有良好的精密度。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密稱取同一批號(20140826)的已知黃芩苷含量為1.796 mg/g的供試品6份，各0.5 g，分別精密加入黃芩苷對照品溶液(濃度為0.035 2 mg/ml)20 ml，按“2.1.2.2”項下方法制成供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件分析，得平均回收率為99.24%，RSD為0.57%。結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.1.8 樣品含量測定 取3批樣品，分別按“2.1.2.2”項下方法制成供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

2.2 定性鑒別試驗

2.2.1 血竭鑒別 取本品2片，研細，加乙醚20 ml，密塞，振搖10 min，濾過，濾液濃縮至1 ml，作為供試品溶液。取除血竭以外的藥材，以原制劑制備方法制成陰性對照品，以供試品溶液方法，制備成陰性對照品溶液。再取血竭對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法試驗(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)，吸取上述溶液各2 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲醇-三氯甲烷(1∶19)為展開劑，展開，取出后晾干。薄層色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品相應(yīng)位置無斑點[5,6]。

1.血竭對照藥材 2.供試品(20140826)

2.2.2 黃芩鑒別 取本品2片，研細，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加10ml水使溶解，用鹽酸調(diào)pH值至3，用醋酸乙酯提取2次，每次20ml，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇2ml使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。取除黃芩以外的藥材，以原制劑制備方法制成陰性對照品，以供試品溶液方法，制備成陰性對照品溶液。照薄層色譜法試驗(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB[1])，吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)為展開劑，預平衡30min后，展開，取出晾干。噴以1%三氯化鐵乙醇試液。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照品相應(yīng)位置無斑點。

1.陰性對照品 2.供試品(20140826) 3.供試品(20140910) 4.供試品(20140928) 5.黃芩苷對照品

3 討論

3.1 檢測波長和流動相 經(jīng)紫外掃描，黃芩苷在277 nm處有最大吸收峰。綜合考慮試驗性質(zhì)，色譜峰情況和經(jīng)濟、毒害等方面因素，選擇乙腈-水-磷酸作為流動相，以乙腈-水-磷酸(30∶70∶0.2)為流動相時，系統(tǒng)保留時間適中，色譜峰分離情況不好，有雜質(zhì)干

擾；當調(diào)整為乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.2)時，色譜分離情況較好，雜質(zhì)干擾較少，故確定檢測波長為277 nm，流動相為乙腈-水-磷酸(35∶65∶0.2)。

3.2 提取方法考查

3.2.1 提取方式 采用超聲處理(溫度控制在25 ℃內(nèi))與加熱回流兩種提取方式對樣品進行處理，結(jié)果超聲提取的含量高于加熱，因而確定提取方式為超聲提取。

3.2.2 提取時間 取同一批號(20140826)的樣品，加入60%甲醇分別超聲20、30、50和60 min，并加以處理，注入液相色譜，測定峰面積。結(jié)果顯示，超聲50 min與60 min，黃芩苷的含量最大，且無明顯差異。故確定處理時間為50 min。

3.2.3 提取溶劑 比較各濃度甲醇提取情況，結(jié)果顯示，采用60%甲醇為提取溶劑時，黃芩苷含量高于其他提取溶劑。故確定60%甲醇為提取溶劑。

本方法建立的通絡(luò)片中黃芩苷的檢驗方法，簡單易行，靈敏度高且重現(xiàn)性良好，薄層色譜鑒定，斑點清晰，可作為該制劑的質(zhì)量控制標準，為臨床合理有效用藥提供依據(jù)。

1 中國藥典[S].一部.2010:282-283

2 陳紅英,倪健,張輝.HPLC法測復方野菊花含片中黃芩苷和蒙化苷含量[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(10):122-124

3 劉紅,劉輝,劉彬果.高效液相色譜法測定急麻顆粒中黃芩苷的含量[J].天津藥學,2014,26(6):11-12

4 王磊,梁穎,付彬,等.皮炎顆粒三方的制備與質(zhì)量研究[J].天津藥學,2014,26(1):24-26

5 中國藥典[S].一部.2010:133

6 后美華,彭建彪.復方龍血竭膠囊質(zhì)量標準研究[J].中國藥品標準,2014,15(5):353-356

Determination of baicalin in Tongluo pills by HPLC

Shen Lin1， Qu Jia2

(1. Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM, Tianjin 300150； 2. Tianjin Institute for Drug Control, Tianjin 300070)

Objective: To develop an HPLC and a TLC method for the determination of baicalin, and for the identification of both baikal skullcap and dragon' s blood in Tongluo pills, respectively．Methods: HPLC was performed on Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm) with mobile phase consists of acetonitrile,water and phosphoric acid (35∶65∶0.2)at room temperature．The flow rate was 1.0 ml/min．The detection wavelength was at 277 nm．Results: Baicalin showed a good linearity in the range of 0.001 76～0.035 20 μg(r=0.999 5).The average recovery was 99.24% with RSD of 0.57%(n=6)；TLC was clear, no negative interference.Conclusion: These methods are simple,reliable and stable,being suitable for the quality control of Tongluo pills．

Tongluo pills，baicalin，HPLC，dragon' s blood

2015-05-19

R927.2

A

1006-5687(2015)04-0022-03