賀小賢， 宇文亞煥， 尹　寧， 魏潔茹， 胡　瑾

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安　710021)

?

影響乳酸菌液芯微囊發(fā)酵性能的制備工藝條件研究

賀小賢， 宇文亞煥， 尹寧， 魏潔茹， 胡瑾

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安710021)

摘要：為了獲得適用于發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的海藻酸鈉(A)-殼聚糖(C)-海藻酸鈉(A)乳鏈球菌6032的液芯微囊，以其發(fā)酵液吸光度值OD600、Nisin的效價為綜合指標，探討了影響ACA乳鏈球菌6032液芯微囊發(fā)酵性能的制備工藝條件.在單因素實驗的基礎上采用Box-Behnken模型響應面設計，建立了乳酸菌ACA液芯微囊制備的三元二次回歸模型，并確定了其制備因素的最佳水平值為殼聚糖溶解時間2 h、攪拌速度236 r/min、制備溫度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.將此條件下制得的乳酸菌ACA液芯微囊發(fā)酵生產(chǎn)Nisin，吸光度值OD600為0.181,Nisin效價為5 242 IU/mL，該結(jié)果與模型預測值擬合良好，說明響應面分析法優(yōu)化該實驗是有效的.

關鍵詞：制備工藝條件； 發(fā)酵性能； ACA乳酸菌液芯微囊

0引言

乳鏈菌肽(Nisin)亦稱乳鏈球菌素或尼生素，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一類初級代謝產(chǎn)物，由34個氨基酸組成的疏水性、小分子多肽化合物[1]，對革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌具有很強的抑菌作用，是食品、藥物管理局和世界衛(wèi)生組織允許商業(yè)化生產(chǎn)的食品添加劑[2]，且已被用于醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè).

近年來，為解決乳酸菌游離發(fā)酵過程中存在的菌體細胞無法重復利用和Nisin產(chǎn)率低下等問題，許多學者對利用細胞微膠囊技術[3,4]發(fā)酵生產(chǎn)Nisin進行了研究.

Kordikanlioglu B等[5]和Simsek O等[6]通過構(gòu)建新的乳酸菌菌株(PLAC7)，增強了其與幾丁質(zhì)的結(jié)合力，提高了幾丁質(zhì)乳酸菌微囊的穩(wěn)定性，實現(xiàn)了連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)Nisin.王永華等[7]用卡拉膠包埋乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)Nisin，得出微囊破損率較高，Nisin效價低于游離水平，但持續(xù)穩(wěn)定發(fā)酵的時間較長；焦中高等[8]采用柱式填充床反應器發(fā)酵雖可減少微囊破損，但Nisin效價低于搖床發(fā)酵；郭凱敏[9]研究表明菌體生長及發(fā)酵液Nisin效價最大的時間比游離細胞大約延遲2 h.

付穎麗等[10]得出制備的海藻酸鈉(A)-殼聚糖(C)-海藻酸鈉(A)E.Coli微囊，在培養(yǎng)時利于菌體細胞的生長和代謝；朱敏莉等[11]不僅確定了ACA液芯微囊的最佳制備工藝條件即各種材料的濃度、pH、各步反應時間，而且也確定了膜強度的顯著影響因子是殼聚糖，并證實了其能更好的培養(yǎng)釀酒酵母和大腸桿菌.

相對于釀酒酵母產(chǎn)生的乙醇，乳酸菌代謝產(chǎn)物Nisin的分子量更大，ACA乳酸菌液芯微囊生產(chǎn)Nisin需要進一步研究.但從制備工藝條件中殼聚糖溶解時間、制備溫度、滴加速度、攪拌速度四個因素對ACA乳酸菌液芯微囊發(fā)酵生產(chǎn)Nisin性能的研究鮮有報道，為了獲得適于持續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的ACA乳鏈球菌6032液芯微囊，本文采用響應面法對其制備條件進行了優(yōu)化研究.

1材料與方法

1.1　材料和儀器

乳鏈球菌(lactococcuslactis)6032，陜西科技大學食品與生物工程學院416實驗室保藏.

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，陜西科技大學食品與生物工程學院416實驗室保藏.殼聚糖(DD≧80%~95% 80目AR Japan)；海藻酸鈉(AR 國藥集團)；無水氯化鈣(粒)(AR 天津市天力)；檸檬酸鈉(AR 天津市天大)；冰乙酸(AR 天津市耀華)；紫外可見分光光度計(UV-1800，MAPADA)；電動攪拌器(D-2000Y，天津市華興科技).

1.2　實驗方法

1.2.1擠壓法制備乳酸菌ACA液芯微囊

將已活化的嗜熱乳酸鏈球菌(6032)按 5%的接種量接于CM種子培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)18 h，離心(4 500 r，10 min)收集菌泥[12]，用生理鹽水調(diào)整濃度至3.0~6.0×109cfu/mL.將一定溫度的海藻酸鈉溶液(10 g/L)與乳酸菌10∶1均勻混合，用一次性5 mL注射器以一定速度滴加到2% CaCl2攪拌溶液中，固化2 h形成海藻酸鈣凝膠珠.用生理鹽水沖洗后，將其置于殼聚糖攪拌溶液(5.5 g/L，pH5.5)中，30 min緩慢成膜，制成海藻酸鈣-殼聚糖膠囊，再用0.05%海藻酸鈉溶液覆膜30 min制得海藻酸鈉(A)-殼聚糖(C)-海藻酸鈣固芯微膠囊，最后用檸檬酸鈉溶液(pH5.5，5%)液化15 min，最終制成乳酸菌ACA液芯微囊.

1.2.2乳酸菌ACA液芯微囊發(fā)酵及評價

利用上述制備的乳酸菌ACA液芯微囊，在蔗糖替代葡萄糖的MRS培養(yǎng)基[13]中發(fā)酵生產(chǎn)Nisin[14].將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液稀釋2倍，與同一發(fā)酵條件下的空白培養(yǎng)基對照，在600 nm處測量吸光度值.將發(fā)酵液調(diào)pH至2.5，采用瓊脂擴散法[15]對Nisin的抑菌效價進行測定.

1.2.3單因素實驗設計

以殼聚糖溶解時間、制備溫度、滴加速度、攪拌速度，進行單次單因素實驗，每個水平重復3次取其平均值，分析各因素對乳酸菌ACA液芯微囊制備及發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的影響.

1.2.4響應面法實驗設計

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，在殼聚糖溶解2 h時，通過Design-Expert軟件采用3因素3水平的Box-Behnken模型響應面設計，考察了攪拌速度、制備溫度、滴加速度3個單因素及其交互作用對實驗結(jié)果的影響.

2結(jié)果與討論

2.1　不同單因素對微囊發(fā)酵性能的影響

2.1.1殼聚糖溶解時間對微膠囊發(fā)酵性能的影響

殼聚糖溶液中的NH3+與海藻酸鈉中的COO-通過正、負電荷作用形成ACA液芯微囊膜.殼聚糖溶解時間對其溶解和降解都有一定的影響.溶解時間短，無法提供大量的NH3+，成膜較差；溶解時間長，殼聚糖降解大，分子量減小，雖易成膜，但其熱穩(wěn)定性減弱，破壞程度更大，微囊穩(wěn)定性差.為了確定最適溶解時間，設計了不同溶解時間進行實驗，實驗結(jié)果如圖1所示.

圖1　殼聚糖溶解時間對微膠囊發(fā)酵性能的影響

由圖1得出，在殼聚糖溶解時間2 h時，吸光度值OD600最小值為0.301，Nisin效價最大值為4 980 IU/mL；在溶解時間5 h時，吸光度值OD600最大值為0.351，Nisin效價最小值為4 600 IU/mL，其數(shù)值相差不大.可能是隨殼聚糖溶解時間延長，提供了大量NH3+和分子量較小的殼聚糖，增加了膜厚度；但其熱穩(wěn)定性減弱，更易被破壞，微囊膜的穩(wěn)定性變差.兩者作用相互抵消，對微囊發(fā)酵性能有影響.響應面設計不考慮溶解時間的影響，故選擇2 h為最佳溶解時間.

2.1.2制備溫度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

制備溫度不但通過改變殼聚糖和海藻酸鈉分子的結(jié)構(gòu)、粘度與運動性能等來影響著微囊的性能，也影響著乳酸菌的存活率，所以制備溫度對微囊發(fā)酵性能有一定的影響.考察了不同制備溫度對微囊發(fā)酵性能的影響，實驗結(jié)果如圖2所示.

圖2　制備溫度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

圖2顯示，在34 ℃之前，隨著制備溫度的增大，吸光度值OD600持續(xù)降低，Nisin效價不斷增大，在34 ℃時，吸光度值OD600降到最小，Nisin效價達到最大.可能是隨著溫度升高，海藻酸鈉和殼聚糖分子粘度降低，分子運動加快，促進其溶解和降解為小分子，利于成膜，增加了膜的厚度；熱穩(wěn)定性減弱使其結(jié)構(gòu)破壞，但微囊穩(wěn)定性整體提高，破損率降低.在34 ℃時細胞游離數(shù)目最少，且菌體細胞存活率最高，利于囊內(nèi)細胞持續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)Nisin.

2.1.3滴加速度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

在往CaCl2溶液中滴加海藻酸鈉時，滴加速度對微囊大小影響顯著.滴加速度慢微囊大，內(nèi)擴散阻力大，不利于傳質(zhì)；滴加速度快微囊小，其比表面積大，傳質(zhì)速度快，頻次高，微囊易受損.設計不同滴加速度實驗，結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，在滴加速度為5 mL/min時，Nisin效價達到最高，而吸光度值OD600并不是最低，可能是此條件下制得的微囊大小、比表面積適宜，益于營養(yǎng)物和產(chǎn)物Nisin傳質(zhì)擴散，能夠為囊內(nèi)細胞及時供給營養(yǎng)和解除產(chǎn)物抑制，利于Nisin生成，但同時傳質(zhì)頻率、次數(shù)的加快也造成微囊破損較大，細胞游離數(shù)較多.

圖3　滴加速度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

2.1.4機械攪拌速度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

在乳酸菌ACA液芯微囊的制備過程中，攪拌速度主要是通過改變流體的雷諾數(shù)，影響微囊所受的切變力.攪拌速度不同時，微囊所受的主要作用力不同.攪拌速度慢，微囊在流體中主要受粘性力作用，成形不規(guī)則，膜厚度及均勻性較差；攪拌速度快，流體慣性力對其影響顯著，會直接使微囊破損.為此設計如下實驗，結(jié)果如圖4所示.

圖4　攪拌速度對微膠囊發(fā)酵性能的影響

由圖4可以看出，在攪拌速度為250 r/min時，吸光度值OD600最小，Nisin效價最大.此后，隨著機械攪拌速度不斷增大，吸光度值OD600一直增大，而Nisin效價持續(xù)降低，可能是流體的慣性力太大使微囊破損嚴重，細胞游離數(shù)目增多，受環(huán)境干擾，細胞活性減少，不利于發(fā)酵生產(chǎn).

2.2　響應面模型的建立以及驗證實驗

2.2.1三元二次回歸模型的建立

響應值R1(OD600)分析方案及實驗結(jié)果如表1所示，方差分析如表2所示.對表1中R1的數(shù)據(jù)進行方差分析后得到模型的二次回歸方程為R1=7.32-3.15E-003*A-0.26*B-0.94*C+3.00000E-005*A*B+1.88E-004*A*C-1.25E-003*B*C+2.78E-006*A＾2+3.73E-003*B＾2+0.097*C＾2.由表2可知，該回歸模型極顯著(p<0.000 1)，失擬項(p=0.105 1>0.05)不顯著，同時該模型的回歸系數(shù)(R2)為0.998 5，說明擬合程度很高，能很好反應響應值R1(OD600)的變化.此外，除交互項BC不顯著外，一次項A、B、C，交互項AB、AC，二次項A2、B2和C2都極顯著.

表1　響應面實驗設計及結(jié)果

表2　響應值1回歸分析結(jié)果統(tǒng)計

表3　響應值2回歸分析結(jié)果統(tǒng)計

續(xù)表3

2.2.2因素間的交互作用

圖5~7直觀地給出了各個因子交互作用對R1值的響應面3D和等值線分析圖.從響應面的最低點和等值線可以看出, 在所選的范圍內(nèi)存在極值, 既是響應面的最低點, 同時也是等值線最小橢圓的中心點.由響應面的傾斜度可以看出各因素間交互影響大小依次為：AC>AB>BC.

圖5　A和B交互效應對細胞游離數(shù)OD600的影響

圖6　A和C交互效應對細胞游離數(shù)OD600的影響

圖7　B和C交互效應對細胞游離數(shù)OD600的影響

響應值R2(Nisin效價)的響應面和等高線如圖8~10所示，經(jīng)比較可以看出，圖8中響應面圖坡度傾斜度較大，表明A與B交互作用較大.

圖8　A和B交互效應對微囊發(fā)酵液Nisin效價的影響

圖9　A和C交互效應對微囊發(fā)酵Nisin效價的影響

圖10　B和C交互效應對微囊發(fā)酵Nisin效價的影響

對響應面結(jié)果利用軟件進行最優(yōu)化分析，得出回歸模型的Nisin效價的最大估計值為5 252.4 IU/mL，吸光度值OD600為0.179，相應的制備條件為攪拌速度235.63 r/min、制備溫度33.67 ℃、滴加速度4.9 mL/min.考慮實際操作將上述條件修正為攪拌速度236 r/min、制備溫度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.在修正后條件下，殼聚糖溶解2 h所制得的乳酸菌ACA液芯微囊發(fā)酵生產(chǎn)Nisin，進行3次平行驗證試驗，Nisin效價為5 242 IU/mL，吸光度值OD600為0.182，與理論預測值相比，其相對偏差為分別0.20%和2.2%，說明響應面擬合所估計的實驗結(jié)果可靠.

3結(jié)論

(1)影響ACA乳酸菌液芯微囊發(fā)酵性能的制備條件，單因素實驗結(jié)果為殼聚糖溶解時間2 h、攪拌速度250 r/min、制備溫度34 ℃、滴加速度5.0 mL/min；

(2)響應面優(yōu)化結(jié)果分析表明，攪拌速度、制備溫度、滴加速度對吸光度值OD600影響均顯著；各因素對Nisin效價影響的大小依次為：制備溫度>滴加速度>攪拌速度.

(3)響應面法優(yōu)化的最優(yōu)制備條件為攪拌速度236 r/min、制備溫度33.7 ℃、滴加速度4.9 mL/min.在此條件下制得的ACA乳酸菌液芯微囊進行發(fā)酵生產(chǎn)時，Nisin效價為5 242 IU/mL，吸光度值OD600為0.182.

參考文獻

[1] Friedrich C L,Moyles D,Beveridge T J,et al.Antibacterial action of structural lydicerse cationic peptides on gram-postive bacteria[J].Anti-microb Agents Chemother,2000

(44):2 086-2 092.

[2] Delves Broughton J.Nisin and its uses as a food preservative[J].Food Technology,1999,44(3):100-117.

[3] A Santillo,M Albenzio,A Bevilacqua,et al.Encapsulation of bacteria in lambrennet paste:Effects on the quality of pecorino cheese[J].Journal of Food Engineering,2012,95(7):3 489-3 500.

[4] 許時嬰,張曉鳴,夏書芹,等.微膠囊技術原理與應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:188-189.

[5] Burcu Kordikanlioglu,Omer Simsek.Continuous nisin production ofLactococcusLactisimmobilized with surface displayed chitin binding domain on chitin[J].New Biotechnology,2012,29(S1):128.

[6] Simsek Omer,Sabanoglu Seba,Con Ahmet Hilmi,et al.Immobilization of nisin producerLactococcusLactisstrains to chitin with surface-displayed chitin-dinding domain[J].Applied Microbiology and Bitechnology,2013,97(10):4 577-4 587.

[7] 王永華,楊博,姚汝華,等.固定化活細胞發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽[J].中國乳品工業(yè),2001,29(2):7-9.

[8] 焦中高,任平國,徐啟宏,等.固定化乳酸乳球菌DL-203發(fā)酵生產(chǎn)Nisin的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2005,26(10):148-153.

[9] 郭凱敏.發(fā)酵泡沫分離耦合生產(chǎn)乳鏈菌肽的工藝研究[D].天津:河北工業(yè)大學,2013.

[10] 付穎麗，雄鷹，劉袖洞，等.海藻酸鈉/殼聚糖微膠囊固定大腸桿菌的研究[J].生物工程學報,2002,18(2):239-241

[11] 朱敏莉,薛偉明,趙彬然,等.ACA液芯微膠囊制備工藝研究[J].化工進展,2010,29(1):124-129.

[12] 郝瑩,王衛(wèi)衛(wèi),馬齊,等.凍干乳酸雙歧桿菌微膠囊的制備及存活性能研究[J].食品科學,2009,30(9):163-166.

[13] Leroy F,Vuyst L.Lactic acid bacteria as functional starter cultu-res for the food fermentation industry[J].Trends in Food Technology,2004,15(2):67-78.

[14] 賀小賢,鄭茂奎,劉歡,等.響應面法優(yōu)化Nisin發(fā)酵的培養(yǎng)條件[J]. 陜西科技大學學報(自然科學版),2014,32(6):119-123,133.

[15] Zhang G Z,Chen L H,Yang T Y.Optimization of determination of Nisin by agar diffusion method[J].Food Science,2007,28(3):176-178.

The liquid core microcapsules preparation conditions

affect onLactobacillusfermentation

HE Xiao-xian, YUWEN Ya-huan, YIN Ning, WEI Jie-ru， HU Jin

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In order to obtain the ACA liquid core microcapsules oflactococcuslactis6032 for Nisin fermentation,absorbance value of OD600and titer unit of Nisin in the broth as comprehensive indicators,the liquid core microcapsules preparation conditions affect on fermentation ofLactobacilluswas discussed.Based on one-factor experimental design,the quadratic model was founded by the Box-Behnken response surface model.The optimal value of each preparation condition were chitosan dissolution time 2 h,stirring speed 236 r/min,temperature 33.7 ℃,dropping rate 4.9 mL/min.Under these conditions,the absorbance value of OD600was 0.181 and the titer unit of Nisin was 5 242 IU/mL,which is consistent with the predicted value.These showed that it is effective for optimizing preparation conditions by response surface methodology.

Key words:preparation conditions; fermentation; ACA liquid core microcapsules ofLactobacillus

作者簡介:賀小賢(1962-)，女，陜西西安人，教授，研究方向：發(fā)酵工程、生物化工

基金項目：國家自然科學基金青年項目(31301059)； 陜西省教育廳自然科學專項科研計劃項目(14JK1089)

*收稿日期:2015-10-20

中圖分類號：TQ920.1

文獻標志碼：A

*文章編號：1000-5811(2015)06-0132-06