邵敏明，江漪，劉妮，張奉學(xué)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

加味升降散對瘦素誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞信號通路的影響

邵敏明，江漪，劉妮，張奉學(xué)

廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405

目的：研究加味升降散對瘦素誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法：以重組大鼠瘦素作用于HSC-T6細(xì)胞，各干預(yù)組在瘦素作用前分別加入加味升降散、N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）、氯化二亞苯基碘嗡（DPI）及JAK抑制劑AG490干預(yù)，再加入瘦素。瘦素組直接加入瘦素，正常組不加任何藥物。另設(shè)只加入加味升降散含藥血清的加味升降散自身對照組。各組處理不同時(shí)間后，檢測細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）mRNA、磷酸化Janus激酶2（JAK2） 及磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活3（STAT3） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：加味升降散干預(yù)12 h、24 h后與瘦素組比較，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞2 h后細(xì)胞質(zhì)p-JAK2及細(xì)胞核內(nèi)p-STAT蛋白表達(dá)與正常組明顯增加（P<0.01），加味升降散干預(yù)后p-JAK2及p-STAT3蛋白表達(dá)明顯低于瘦素組（P<0.01）。結(jié)論：加味升降散能阻斷瘦素在肝星狀細(xì)胞信號內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制TIMP-1的基因表達(dá)。

加味升降散；瘦素；肝星狀細(xì)胞；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

肝纖維化是一切慢性肝病共同的病理學(xué)基礎(chǔ)，近年來，瘦素作為一種新的致纖維化細(xì)胞因子逐漸受到重視［1］，其主要機(jī)制是通過結(jié)合瘦素激活磷酸化Janus激酶2-磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活3（JAK2-STAT3）引起肝星狀細(xì)胞增殖、抑制其凋亡，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1），抑制基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達(dá)，能直接抑制活化的HSC凋亡從而引起肝纖維化［2～3］。加味升降散具有升清降濁、活血護(hù)肝之功，本實(shí)驗(yàn)觀察中藥復(fù)方加味升降散對瘦素刺激肝星狀細(xì)胞信號通路的影響，探討該方抗肝纖維化機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料重組大鼠瘦素（Leptin）購自Peprotech公司；氯化二亞苯基碘嗡（DPI）購自美國Sigma-Aldrich公司；N-乙酰-L半胱氨酸（NAC）購自北京索萊寶科技有限公司；α-氰基-（3，4-羥基）N-芐苯乙烯胺（AG490）購自Invitrogen公司；RNA提取試劑盒等均為TIANGEN公司產(chǎn)品。DNA Marker、PCR試劑盒、優(yōu)化PCR試劑盒為天為時(shí)代生物技術(shù)公司產(chǎn)品。p-JAK2抗體、p-STAT3抗體購自廣州吉坤生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞（HSC）-T6細(xì)胞株，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒室凍存復(fù)蘇。

1.3含藥血清的制備SD大鼠4只，SPF級，體重（200± 30）g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供（合格證：粵檢驗(yàn)證字第2008A04號）。給予加味升降散溶液灌胃，早晚各1次，給藥量為11g/kg。連續(xù)3天，最后一次給藥后1 h，下腔靜脈取血，離心，取上層血清，過濾除菌，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理HSC-T6隨機(jī)分為7組進(jìn)行處理：按加入藥物不同分為瘦素組（100 ng/mL），加味升降散（50 μmol/L）組、NAC（10 mmol/L）組、DPI（20 μmol/L）組、AG490 （50 μmol/L）組、加味升降散（50 μmol/L）自身對照組和正常組。加味升降散組、NAC組、DPI組、AG490組先加入相應(yīng)溶液預(yù)處理30 min后，再加入瘦素。瘦素組直接加入瘦素，正常組僅加入培養(yǎng)液、加味升降散自身對照組僅加入含藥血清（50 μmol/L）的培養(yǎng)液，不加瘦素。

1.5RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)TIMP-1 mRNA的表達(dá)細(xì)胞傳代至6孔板，按上述分組分別加入藥物作用6、12、24 h后，按Trizol試劑說明書提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增：TIMP-1和β-actin引物序列見表1所示，TIMP-1和β-actin的退火溫度分別是54℃、55℃。擴(kuò)增體系：95℃，5 min，預(yù)變性94℃，30 s，54/55℃，30 s，72℃，1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃，7 min，終末延伸，最后進(jìn)行凝膠電泳。

1.6免疫細(xì)胞化學(xué)方法測定細(xì)胞中磷酸化Janus激酶2（p-JAK2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活3（p-STAT3） 的活性按照實(shí)驗(yàn)分組，對7組細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞爬片。隨后采用PV6002二步法免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測p-JAK2，p-STAT3蛋白的活性。結(jié)果判斷：每張細(xì)胞爬片于顯微鏡放大倍數(shù)×200下觀察，先觀察整張細(xì)胞爬片，后每片隨機(jī)選取5個(gè)視野，測陽性細(xì)胞所占比率。p-JAK2蛋白表達(dá)以胞漿染呈黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞，無著色為陰性，計(jì)算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p-STAT3蛋白表達(dá)以細(xì)胞核染呈黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞，無著色為陰性。核移位陽性率（%）=核移位陽性細(xì)胞/視野下細(xì)胞總數(shù)×100%，以此為計(jì)量指標(biāo)，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果

2.1A~G組TIMP-1mRNA表達(dá)比較見圖1、圖2、圖3。6 h瘦素組TIMP-1mRNA的表達(dá)與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；12 h、24 h的TIMP-1mRNA表達(dá)較正常組升高（P＜0.05）；6 h加味升降散組、NAC組及 DPI組TIMP-1mRNA的表達(dá)與同時(shí)間段瘦素組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），12 h、24 h加味升降散組的TIMP-1mRNA表達(dá)明顯低于同時(shí)間段瘦素組（P＜0.05），與同時(shí)間段正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2各組p-JAK2、p-STAT3的活性比較見表2。各組HSC-T6細(xì)胞漿內(nèi)p-JAK2蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)瘦素處理過后胞漿表達(dá)p-JAK2蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加味升降散組、NAC組和DPI組蛋白表達(dá)低于瘦素組（P＜0.05），但高于正常組（P＜0.05）；加味升降散自身對照組表達(dá)低于正常組（P＜0.05）。各組HSC-T6細(xì)胞核內(nèi)p-STAT3蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)瘦素處理過后細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)p-STAT3蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；AG490干預(yù)組的p-STAT3蛋白表達(dá)顯著低于瘦素組（P＜0.05），與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加味升降散組蛋白表達(dá)低于NAC組和DPI組（P＜0.05），與AG490組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；加味升降散自身對照組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2　各組p-JAK2、p-STAT3的活性比較±s）

與正常組比較，①P＜0.05；與瘦素組比較，②P＜0.05；與加味升降散組比較，③P＜0.05

組別瘦素組加味升降散組N A C組D PI組A G 490組加味升降散自身對照組正常組陽性率p-JA K 2 95.97±3.21①84.50±2.18①②89.22±3.26①②83.41±3.53①②47.33±4.21①②41.52±4.19①57.17±4.82 p-STA T3 86.65±10.76①25.52±2.77②38.25±6.68②③41.33±5.17②③21.49±3.28②20.16±5.04②26.67±3.63

3　討論

加味升降散的組方是在清·楊璇《傷寒溫疫條辨》中升降散（僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃）的基礎(chǔ)上加用三七、丹參、桃仁、白花蛇舌草等藥物組成，具有升清降濁、調(diào)補(bǔ)氣血、活血化瘀、清熱解毒、驅(qū)穢祛邪、疏肝解郁及補(bǔ)氣健脾功效。此方體現(xiàn)了“升清降濁”的治法。姜黃、大黃二藥主沉降，降陰中之濁陰，僵蠶、蟬蛻二藥輕浮，升陽中之清陽，升清降濁法通過兩味君藥的“降濁”之功，直接排除機(jī)體內(nèi)病理產(chǎn)物，而其“升清”則能夠促進(jìn)精微物質(zhì)的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化和利用。并且，升降運(yùn)動兩者互根互用，升降相因，升清和降濁可以相互促進(jìn)，相互制約。升清降濁中的“降濁”，可將化痰利濕、活血化瘀、瀉熱祛濕、解毒辟疫、清絡(luò)祛熱、疏肝利膽、消滯通腑等治法融于一體，多途徑、多環(huán)節(jié)地清除體內(nèi)堆積的濁毒產(chǎn)物，其“升清”法開通內(nèi)外、平調(diào)升降，能增強(qiáng)人體轉(zhuǎn)化的能力，減少代謝產(chǎn)物“濁陰”的堆積。這種雙向調(diào)節(jié)體內(nèi)物質(zhì)代謝的方法，較傳統(tǒng)的化痰除濕，活血化瘀等單純降濁法具有更多的治療優(yōu)勢。

近來的研究表明，TIMP既可抑制金屬蛋白酶活性，也可保持金屬蛋白酶原的穩(wěn)定性，及防止其酶原活化［4］。TIMP-1 和TIMP-2可與金屬蛋白酶原的非催化位點(diǎn)結(jié)合，抑制酶原的活化。此現(xiàn)象首見TIMP-2與明膠酶A酶原的結(jié)合上：TIMP-2可與明膠酶A酶原的羧基端結(jié)合，常以一種酶原-抑制物復(fù)合物的形式分泌。當(dāng)以此種方式結(jié)合時(shí)，TIMP-2可抑制明膠酶A的活化。金屬蛋白酶細(xì)胞外活性的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，包括各種不同形式和相互作用的機(jī)制。TIMPs作用的最新概念包括對酶原活化的選擇性和催化位點(diǎn)的抑制。不同的TIMPs可以不同的方式結(jié)合并影響不同的金屬蛋白酶［5］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，瘦素刺激HSC后，TIMP-1mRNA較正常組表達(dá)水平明顯增高。在給予JAK抑制劑AG490能抑制TIMP-1mRNA表達(dá)，上調(diào)MMP-1mRNA表達(dá)，說明瘦素通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對TIMP-1mRNA進(jìn)行調(diào)控的。而抗氧化劑NAC和NOX抑制劑DPI也能抑制TIMP-1mRNA表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)加味升降散干預(yù)后能抑制瘦素誘導(dǎo)的TIMP-1 mRNA表達(dá)，上調(diào)MMP-1mRNA表達(dá)。

HSC-T6細(xì)胞經(jīng)加味升降散處理后，凋亡率升高，表明加味升降散可誘導(dǎo)HSC凋亡。在瘦素作用HSC-T6細(xì)胞前給予加味升降散處理后，p-JAK2、p-STAT3的表達(dá)下降，表明加味升降散能夠抑制JAK2、STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。加味升降散抑制STAT3磷酸化蛋白的表達(dá)后，有效的阻止了磷酸化STAT3形成二聚體移位到細(xì)胞核內(nèi)，從而影響了基因的轉(zhuǎn)錄，如抑制TIMP-1mRNA表達(dá)，上調(diào)MMP-1mRNA表達(dá)。結(jié)果表明通過抑制JAK2、STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也是加味升降散抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡的機(jī)制之一。

［1］Pouer JJ，Womack L，Mezey E，et al.Transdifferentiation of rat hepatic stellate cells results in leptin expression［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，244（1）：178-182.

［2］Bertolani C，Marra F.Role of adipocytokines in hepatic fibrosis［J］.Curr Pharm Des，2010，16（17）：1929-1940.

［3］Cao Q，Mak KM，Ren C，et al.Leptin stimulates tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in human hepatic stellate cells：respective roles of the JAK/STAT and JAK-mediated H2O2-dependant MAPKpathways［J］.J BiolChem，2004，279（6）：4292-4304.

［4］Buday L，Downward J.Many faces of Ras activation［J］. Biochim Bio physacta，2008，1786（2）：178-187.

［5］Shaul YD， Seger R.The MEK/ERK cascade：from signaling specificity to diverse functions［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1773（8）：1213-1226.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

R285.5

A

0256-7415（2015）03-0241-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.03.116

2014-10-11

邵敏明（1986-），女，在讀博士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。

張奉學(xué)，E-mail：zhangfengxue@gzucm.edu.cn。