張強 （安徽科技學院生命科學學院，安徽 蚌埠233100）

食品安全問題不僅會影響廣大人民群眾的身體健康和生命安全，而且還制約著整個國家的經(jīng)濟發(fā)展。然而，當下的食品安全問題形勢嚴峻，問題頻發(fā)，三聚氰胺、蘇丹紅、致癌毒米、阜陽大頭娃娃奶粉以及瘦肉精等數(shù)十起食品安全事件被曝光后，引起了人們的極大關注［1］。目前，應用于食品安全檢測的技術有儀器檢測法、化學分析檢測法、免疫分析檢測法、定性、定量、在線監(jiān)測檢測法等［2］。酶聯(lián)免疫吸附測定 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種免疫分析檢測方法，具有操作簡便、有效、特異性強、靈敏度高、不需要昂貴的儀器設備等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應用于藥物殘留、重金屬污染、生物毒素、食品添加劑檢測等諸多方面［3，4］。筆者對ELISA技術在食品安全檢測中的應用進行了綜述，并就其在應用中存在的不足及發(fā)展趨勢和應用前景進行了探討，旨在進一步促進該技術在食品安全檢測領域的應用和推廣。

1 ELISA技術簡介

ELISA技術是一種將抗原、抗體免疫反應的特異性與酶催化作用的高效性有機地結合起來的一種非放射性應用型檢測方法。ELISA技術的基礎是抗原或抗體的固相化及抗體或抗原的酶標記，其基本原理包括：抗體 （抗原）吸附在固相載體的外表面，并維持抗體 （抗原）的免疫活性；抗體 （抗原）能通過共價鍵來與酶連接而形成酶復合物，并維持原有的免疫學和酶學活性；酶復合物與對應的抗體 （抗原）結合后，可根據(jù)加入底物后的顏色改變來判定試驗結果［5］。

ELISA技術可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在測定過程中有3個必要的試劑，即固相的抗原或抗體 （免疫吸附劑）、酶標記的抗原或抗體 （結合物）和酶反應的底物。根據(jù)這些試劑結合方式的不同，ELISA技術主要分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法等幾種不同應用類型［6］。

2 ELISA在食品安全性檢測中的應用

2.1 生物毒素檢測

生物毒素也稱為天然毒素，是生物體分泌代謝或半生物合成產(chǎn)生的、不可自復制的有毒化學物質(zhì)。目前，已發(fā)現(xiàn)的的生物毒素有數(shù)千種，依據(jù)來源可以把生物毒素分為微生物毒素、植物毒素和動物毒素［7］。存在于食物中的毒素往往會引起食物中毒、胃腸炎、溶血性貧血甚至癌癥等威脅人類健康的疾病，其在食品中的含量在每個國家都具有嚴格控制標準［8］。黃曲霉毒素B1是黃曲霉毒素中毒性最強、危害最大的一種［9］。劉蓉等［10］利用基因工程手段制備了黃曲霉毒素B1的單鏈抗體，將其用于ELISA檢測方法以檢測醬油中黃曲霉毒素B1的含量，其檢測限為0.10ng／mL，平均加標回收率在84%～109%之間；肖智等［11］將黃曲霉毒素B1轉(zhuǎn)化為半縮醛B2a，再以B2a為半抗原通過雜交瘤技術制備了黃曲霉毒素B1高特異性單克隆抗體，通過ELISA技術對黃曲霉毒素B1的檢測限為 （0.6±0.078）ng／mL，抗體與其他黃曲霉毒素的交叉反應率顯著降低；Wang等［12］建立了基于多克隆抗體檢測黃曲霉毒素M1的ELISA快速分析方法，該法檢測限為1.0ng／mL。目前，ELISA技術除了應用于食品中黃曲霉毒素的檢測外，還在脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DON）、赤霉烯酮 （ZEN）等其他真菌毒素［13］及河豚毒素、蓖麻毒素和苦馬豆素等動物和植物源毒素［14］檢測方面得到了廣泛的應用，并均取得了較理想的效果，表明該法在食品毒素檢測方面大有潛力可挖，值得進一步應用。

2.2 致病微生物檢測

病原微生物可引起食源性疾病，是食品生物性污染的重要因素，也是影響食品安全的主要因素之一。傳統(tǒng)的病原微生物學檢查以染色、培養(yǎng)、生化鑒定等為主，將標本直接涂片染色鏡檢和接種在培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法［15］。這些常規(guī)方法需要大量的手工勞動，檢驗周期長，對特征菌落的判定受主觀因素影響較大，容易漏檢，無法滿足現(xiàn)代對微生物快速檢測的需要，而ELISA技術在這方面具有一定優(yōu)勢。目前，已有許多研究者借助ELISA技術建立了食品中有害菌的檢測方法。李建科等［16］建立了果汁中耐熱菌的間接性ELISA檢測方法，檢測限為5×104CFU／mL，檢測時間比目前國內(nèi)外普遍采用的美國庫克食品實驗室檢測法縮短3～4d；張顯昱等［17］建立了能夠快速檢測樣品中鮰愛德華菌的競爭性ELISA檢測方法，該方法對鮰愛德華菌的最低檢測量為1×106cells／mL，具有良好的靈敏性和特異性；伍燕華等［18］建立了快速檢測食品中沙門氏菌的雙抗夾心ELISA方法，該法最低檢測量為1×104CFU／mL，與其他雜菌不存在交叉反應，可以快速、準確地檢測食品中的沙門氏菌。目前，ELISA法可用于檢測食品中單核細胞增生李斯特菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌、軍團菌、假單胞菌屬、大腸桿菌O－157、致賀氏菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌和臘樣芽抱桿菌等多種致病微生物，在病原微生物檢測方面具有很大的發(fā)展空間。

2.3 重金屬污染檢測

隨著環(huán)境污染的日益加劇，食品原料或成品的重金屬污染也日趨嚴重，如何快速、有效地檢測出受重金屬污染的食品迫在眉捷。傳統(tǒng)的重金屬檢測方法有原子吸收光譜法、X射線熒光光譜法、電感耦合等離子發(fā)射光譜法 （ICP－AES）等，該類方法準確、敏感，但儀器較昂貴，操作復雜，需要專業(yè)的工作人員，不適于大規(guī)?？焖倨詹椤＝陙?，ELISA技術在食品中重金屬檢測方面得到了迅速發(fā)展。郭常偉等［19］建立了樣品中銅離子的間接競爭性ELISA檢測方法。該法最低檢測限為2.0ng／mL，與ICPAES法檢測結果的總符合率超過94%；方淑兵等［20］建立了重金屬汞離子的間接競爭性ELISA分析方法，該法檢測限為0.45μg／L，靈敏度為4.10μg／L，與其他金屬均無明顯交叉反應，與電感耦合等離子體質(zhì)譜 （ICP－MS）法檢測結果具有很好的相關性 （相關系數(shù)為0.988）；楊依錦等［21］建立了重金屬鉛的間接競爭性ELISA檢測方法，最低檢出限為0.32ng／mL，與ICP－MS法檢測結果的總符合率超97%；王津等［22］建立了樣品中鎘離子的間接競爭性ELISA檢測法，其檢測限為0.76μg／L，與其他金屬螯合物的交叉反應率均低于1.32%。上述研究結果表明，ELISA法具有較高的準確性，適用于樣品中重金屬的快速篩選和檢測。

2.4 農(nóng)藥殘留檢測

自1983年以來，ELISA技術已成為國際上分析農(nóng)藥殘留的首選方法，目前已廣泛用于有機磷類、有機氯類、除蟲菊酯、磺胺類等農(nóng)藥殘留的檢測［23］。方松等［24］建立了基于多克隆抗體的氯噻啉間接競爭酶性ELISA分析方法，該方法的最低檢測限為1.8μg／L，所得多克隆抗體除與吡蟲啉有較大的交叉反應外，與其他結構相似的化合物無明顯交叉反應；余鵬敏等［25］建立了樣品中乙草胺含量的間接競爭性ELISA檢測法，該方法靈敏度高、特異性強，檢測限為24.4μg／L，與結構相似的其他農(nóng)藥無明顯交叉反應，適合環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中乙草胺的檢測；韋倩妮等［26］建立了有機磷農(nóng)藥三唑磷的間接性ELISA檢測法，該方法最低檢測限為1.0μg／L，定量檢測線性范圍為2.5～100.0μg／L，具有高度的特異性，與其他有機磷農(nóng)藥結構類似物無明顯交叉反應。目前，許多國家已開發(fā)出相應的ELISA檢測試劑盒，可用于直接檢測果蔬等植物性食品中的農(nóng)藥殘留。

2.5 獸藥殘留檢測

食品中獸藥殘留是影響世界各國食品安全的主要因素。食品中獸藥殘留主要包括抗生素類、激素藥類、抗球蟲類、呋喃藥類、磺胺藥類和驅(qū)蟲藥類藥物。目前，關于動物性食品獸藥殘留檢測中ELISA法的應用已取得顯著成效。楊君宏等［27］建立了一種檢測牛組織中阿維菌素類藥物 （Avermectins，AVMs）殘留的間接競爭性ELISA方法，該法可同時檢測牛肝臟和肌肉中阿維菌素、伊維菌素和埃普里諾菌素殘留，檢測限為1.1ng／mL；姜金慶等［28］建立了樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的間接競爭性ELISA檢測方法，檢測限為0.1ng／mL，該法對恩諾沙星、諾氟沙星和培氟沙星均能特異性識別；王鶴佳等［29］建立雞肉中尼卡巴嗪殘留的競爭性ELISA檢測方法，在雞肉中檢測限為9.2μg／kg，在精密度、靈敏度和準確度方面均能滿足獸藥殘留篩選檢測要求。上述研究結果表明，隨著ELISA技術的不斷完善和發(fā)展，其在動物性食品中獸藥殘留檢測方面的應用前景將十分廣闊。

2.6 轉(zhuǎn)基因食品的檢測

隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品種類和數(shù)量的不斷增多，轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的安全性也越來越受到人們關注，越來越多的國家要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實行標簽制度，這就對轉(zhuǎn)基因食品的檢測提出了更高的要求。目前，ELISA技術已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測。顧煒煒等［30］研制了用于檢測轉(zhuǎn)Btcry2Ab／2Ac殺蟲蛋白基因食品的直接競爭性ELISA試劑盒，最低檢測限為40ng／mL，可用于轉(zhuǎn)基因食品的快速、批量檢測；朱振營等［31］建立了轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人乳鐵蛋白的夾心ELISA檢測方法，檢測限為0.25×10－3g／L；劉志浩等［32］建立了檢測轉(zhuǎn)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因玉米的雙抗體夾心ELISA檢測方法，并與傳統(tǒng)的聚合酶鏈式反應 （PCR）檢測法進行比較，2種檢測方法的符合率為100%，確定了該方法的準確性和可靠性；Guerler等［33］建立了轉(zhuǎn)CryAb蛋白基因食品的雙抗體夾心ELISA檢測法，對CrylAb蛋白的分析檢測限為0.4ng／mL，檢測特異性優(yōu)于實時熒光PCR，證實了ELISA技術在轉(zhuǎn)基因食品的檢測中具有可利用性。

2.7 過敏原的檢測

食品的過敏反應已成為人類生活中普遍存在的一個嚴重問題，引起了人們的廣泛關注。建立有效的食品過敏原檢測方法是過敏原安全管理的技術保障。目前ELISA技術是除PCR反應以外的另一種非常重要的檢測方法。張潔瓊等［34］建立了杏仁過敏原苦杏仁球蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測方法，該法對甜杏仁中苦杏仁球蛋白的檢測限為 （6.36±1.02）μg／L，與常見的14種植物性蛋白沒有交叉反應；談超等［35］建立了綠豆過敏原蛋白間接競爭性ELISA檢測方法，該法檢出限為 （0.72±0.035）μg／mL；吉坤美等［36］建立了食物中花生過敏原蛋白的雙抗體夾心ELISA檢測法，該法特異性強，其最低檢出限為8ng／mL。上述研究表明ELISA技術是一種實用、靈敏、特異性強的食品中過敏原的檢測方法。

2.8 食品中違法添加的非食用物質(zhì)的檢測

違法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑是導致食品質(zhì)量安全問題的重要原因之一。近年來出現(xiàn)的如瘦肉精、三聚氰胺以及蘇丹紅等食品安全事件，反映出當前在食品生產(chǎn)和加工過程中濫用食品添加劑和違法添加非食用物質(zhì)的問題十分嚴重。因此，ELISA技術作為一種簡單、經(jīng)濟以及快速的檢測方法對于食品中違法添加劑的分析檢測尤為重要。王黎麗等［37］建立了基于單克隆抗體的三聚氰胺間接和直接競爭性ELISA檢測方法，2種檢測法的檢測限分為0.079μg／L和0.12μg／L；郭杰標等［38］建立了保健酒中非法添加雙氯芬酸的競爭性ELISA檢測方法，其最低檢出限為2.0ng／mL，與8種相關藥物交叉反應率都小于0.1%。范祚舟［39］建立了一種能夠快速檢測食品中蘇丹紅的間接競爭性ELISA檢測法，對于蘇丹紅I檢測的IC50為0.34ng／mL；汪惠澤［40］建立了樣品中鹽酸克倫特羅的間接競爭性ELISA檢測方法，該法檢測限低于0.5ng／mL，交叉實驗表明，該法具有高度的特異性，與其他一些P－腎上腺素激動劑藥物無交叉反應。

3 ELISA技術存在的主要問題

與其他分析檢測技術相比，ELISA技術的優(yōu)勢在于特異性強、靈敏度高、測定成本低、樣品處理量大、對儀器設備要求不高、方法快速簡便、自動化程度高、無放射性同位素污染等，但其在食品安全檢測的應用過程中也存在著一些問題。首先，該方法需要較多的儀器設備，如酶標儀、冰箱及恒溫箱等，不適宜基層現(xiàn)場檢測。其次抗體制備較困難。一方面，一些單克隆抗體制備的時間較長 （至少2個月），另一方面有些被檢測樣品分子量小，必須與BSA等大分子蛋白質(zhì)偶聯(lián)后才具備免疫原性，而且并非所有的小分子被檢樣品都能制備出用于免疫分析的抗體，因為其受該物質(zhì)的結構和載體蛋白的連接位置等多種因素的影響。再次，對與待檢樣品結構類似的化合物有一定程度的交叉反應，容易出現(xiàn)假陽性，將導致定量檢測準確度降低。此外，由于食品的樣本類型復雜，基質(zhì)效應可能抑制免疫結合反應。不同待測樣品性質(zhì)各異，處理方法存在許多不確定性，同時抗體特異性和穩(wěn)定性對檢測結果影響機制尚不清楚，影響其特異性和穩(wěn)定性的因素還不是很明確，使得不確定因素增多且不易控制，難以實現(xiàn)標準化。

4 ELISA技術的發(fā)展趨勢與應用前景

目前，ELISA技術在食品安全檢測中的應用越來越廣泛，伴隨科學技術的進步，該技術必將產(chǎn)生新的發(fā)展趨勢，具體內(nèi)容如下：開發(fā)具有高度免疫性的重組抗原來代替無法分離的原始抗原物質(zhì)以提高其免疫原性；將酶體外定向進化應用到檢測中 （一種同時具有催化底物顯色反應的酶活性和特異性抗體或抗原性質(zhì)的融合蛋白），避免酶與特異性抗體或抗原的化學交聯(lián)過程，從而大大地提高檢測結果的穩(wěn)定性和重復性；加強標準化，促進商品化的應用；與其他檢測方法如PCR、色譜技術等相結合，實現(xiàn)強強聯(lián)合，擴大其優(yōu)勢、改善弊端。隨著研究的不斷深入，相信ELISA技術的應用范圍會越來越廣，檢測限會越來越低，穩(wěn)定性越來越強，檢測時間越來越短，費用越來越低，ELISA技術在未來食品安全的快速檢測中將發(fā)揮更加突出和重要的作用，從而使食品安全檢測技術愈加精確、簡單、方便。

［1］ 宣偉，王軍，汪秀月，等.食品安全檢測技術研究進展 ［J］.肉類研究，2011，（9）：47～51.

［2］ 隋廣文.食品安全檢測技術綜述 ［J］.科技傳播，2013，（14）：81～82.

［3］ 于振，周雪林，陳娟，等.食品安全檢測中的酶聯(lián)免疫技術應用 ［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2014，（9）：58～61.

［4］ 孔濤，郝貴增，郝雪琴，等.ELISA在飼料及食品安全檢測中的應用 ［J］.飼料研究，2012，（7）：73～75.

［5］ 方禮祿，王朝軍，徐利，等.應用ELISA檢測我國豬病的研究進展 ［J］.飼料博覽，2013，（9）：38～42.

［6］ 丁曉燕，盧平，胡德禹.酶聯(lián)免疫分析方法在有機磷農(nóng)藥殘留檢測中的應用研究進展 ［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學報，2011，30（6）：547～553.

［7］ 許艷麗，鮑蕾，靜平，等.生物傳感器在生物毒素檢測中的應用進展 ［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，2012，（5）：432～436.

［8］ 何紫薇，郭琦.酶聯(lián)免疫吸附 （ELISA）技術在食品檢驗的發(fā)展應用 ［J］.科協(xié)論壇，2012，（11）：71～72.

［9］ 王桂才.黃曲霉毒素B1檢測方法的研究分析 ［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（4）：239～240.

［10］ 劉蓉，楊煉，孫秀蘭，等.應用抗黃曲霉毒素單鏈抗體檢測醬油中黃曲霉毒素B1［J］.食品工業(yè)科技，2011，（1）：281～283.

［11］ 肖智，李培武，張奇，等.高特異性黃曲霉毒素B1單克隆抗體的制備及特性研究 ［J］.中國油料作物學報，2011，（1）：66～70.

［12］ Wang J J，Liu B H，Hsu Y T，et al.Sensitive competitive direct enzyme－linked immunosorbent assay and gold nanoparticle immunochromatographic strip for detecting aflatoxin M1in milk ［J］.Food Control，2011，22：964～969.

［13］ 戚紅卷，榮釗，岳麗君，等.一種酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)用于米面中真菌毒素檢測的效果評價 ［J］.醫(yī)療衛(wèi)生裝備，2014，35（8）：75～78.

［14］ 林壯森，張焜，趙肅清，等.食品中生物毒素的ELISA分析方法研究進展 ［J］.食品科學，2009，（3）：281～283.

［15］ 云云，汪長中，吳璇.病原微生物檢測技術進展 ［J］.安徽醫(yī)藥，2013，（3）：501～503.

［16］ 李建科，王峰，夏凱.蘋果濃縮汁中耐熱菌的間接ELISA快速檢測方法 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，44（22）：4669～4677.

［17］ 張顯昱，李強，李明，等.兩種鮰愛德華菌ELISA快速檢測方法的建立與應用 ［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2013，15（3）：175～182.

［18］ 伍燕華，牛瑞江，賴衛(wèi)華，等.雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測沙門氏菌 ［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（10）：62～65.

［19］ 郭常偉，唐勇，向軍儉，等.重金屬銅離子單克隆抗體的制備及其間接競爭ELISA檢測方法的建立 ［J］.中國生物制品學雜志，2011，24 （6）：720～723.

［20］ 方淑兵，王俊平，王碩，等.重金屬汞酶聯(lián)免疫檢測方法的建立 ［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（16）：86～88.

［21］ 楊依錦，王俊平，王津，等.重金屬鉛酶聯(lián)免疫檢測方法的研究 ［J］.食品與機械，2012，（3）：80～83.

［22］ 王津，生威，王俊平，等.間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測水樣中的重金屬鎘 ［J］.食品與機械，2012，（3）：84～86.

［23］ 于偉.酶聯(lián)免疫技術在食品檢測中的應用 ［J］.黑龍江科技信息，2012，（11）：73～74.

［24］ 方松，張斌，施海燕，等.氯噻啉酶聯(lián)免疫分析方法研究 ［J］.農(nóng)藥學學報，2011，13（3）：287～292.

［25］ 余鵬敏，施海燕，王鳴華.乙草胺的酶聯(lián)免疫吸附分析技術 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學報，2011，27（2）：420～425.

［26］ 韋倩妮，黃魁英，雷紅濤，等.有機磷農(nóng)藥三唑磷單克隆抗體制備及鑒定 ［J］.食品科學，2011，32（1）：154～157.

［27］ 楊君宏，何繼紅，侯曉林，等.ELISA方法檢測牛組織中的阿維菌素類藥物殘留 ［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，（9）：70～72.

［28］ 姜金慶，楊雪峰，王自良，等.氟喹諾酮類藥物多殘留間接競爭ELISA檢測方法的建立 ［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2011，33（11）：887～892.

［29］ 王鶴佳，劉智宏，汪霞，等.酶聯(lián)免疫法測定雞肉中尼卡巴嗪殘留 ［J］.中國獸藥雜志，2014，48（3）：59～61.

［30］ 顧煒煒，潘家榮.轉(zhuǎn)基因食品中Btcry2Ab／2Ac殺蟲蛋白直接競爭ELISA試劑盒的研制 ［J］.食品科技，2007，（6）：203～206.

［31］ 朱振營，劉建，林祥梅，等.轉(zhuǎn)基因牛奶及奶制品中人乳鐵蛋白夾心ELISA檢測方法的建立 ［A］.中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會.中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十六屆學術研討會論文集 ［C］.哈爾濱：中國畜牧獸醫(yī)學會，2012.

［32］ 劉志浩，高麗麗，王新桐，等.轉(zhuǎn)基因玉米中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立 ［J］.西北農(nóng)林科技大學學報 （自然科學版），2013，（11）：45～50.

［33］ Guertler P，Paul V，Albrecht C，et al.Sensitive and highly specific quantitative real－time PCR and ELISA for recording apotential transfer of novel DNA and Cry1Ab protein from feed into bovine milk ［J］.Analytical and bioanalytical chemistry，2009，393：1629～1638.

［34］ 張潔瓊，高淑霞，生威，等.雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測杏仁過敏原苦杏仁球蛋白 ［J］.食品科學，2013，34（16）：173～177.

［35］ 談超，高愛華，張燕，等.綠豆過敏原多克隆抗體制備及間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立 ［J］.中國食品學報，2013， （7）：170～174.

［36］ 吉坤美，陳家杰，湯慕瑾，等.雙抗體夾心ELISA法測定食物中花生過敏原蛋白成分 ［J］.食品研究與開發(fā)，2009，（6）：110～114.

［37］ 王黎麗，陳芳芳，吳超，等.基于單克隆抗體的三聚氰胺ELISA檢測方法的建立 ［J］.食品與生物技術學報，2012，30（6）：962～966.

［38］ 郭杰標，李杏娉，郝卿辰，等.保健酒違法添加雙氯芬酸免疫檢測方法的建立 ［J］.食品與機械，2013，29（4）：59～62.

［39］ 范祚舟.蘇丹紅Ⅰ半抗原的改造及其抗體制備 ［D］.南京：南京大學，2012.

［40］ 汪惠澤.鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備及其CiELISA檢測方法的建立 ［D］.揚州：揚州大學，2012.