劉小微，王松坡

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080)

缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)腫瘤多藥耐藥的影響及其靶向治療的研究進(jìn)展

劉小微，王松坡

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海 200080)

腫瘤多藥耐藥；缺氧；缺氧誘導(dǎo)因子；靶向治療；中西醫(yī)結(jié)合療法

腫瘤的多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是高效率化療發(fā)展的主要障礙。由于腫瘤組織的結(jié)合和腫瘤細(xì)胞高效率的糖酵解，許多類型的人類腫瘤細(xì)胞都有顯著剝奪氧氣的特性，這個(gè)現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)[1]，缺氧是腫瘤細(xì)胞的屬性。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)作為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，與腫瘤的多藥耐藥密切相關(guān)。同時(shí)，以HIF為靶向治療的中西醫(yī)研究具有重要的理論和臨床意義，為逆轉(zhuǎn)MDR提供了新策略。

1 腫瘤多藥耐藥

癌癥患者化療失敗的原因多數(shù)是由于體內(nèi)或獲得性地產(chǎn)生了對(duì)化療藥物的耐藥性。這種耐藥性是腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)對(duì)結(jié)構(gòu)和靶細(xì)胞不同的另一些化療藥物產(chǎn)生了交叉耐藥性。這種現(xiàn)象被稱為MDR[2]。一旦出現(xiàn)MDR，采用更高劑量的化療藥也是無(wú)效的，反而會(huì)出現(xiàn)進(jìn)一步誘發(fā)的耐藥性和藥物毒性。MDR產(chǎn)生的機(jī)制與多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密切相關(guān)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)100余種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)、肺耐藥相關(guān)蛋白(lung resistance-related protein，LRP)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)等。它們的特點(diǎn)是具有泵功能的跨膜蛋白的過(guò)度表達(dá)，使進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物被泵排除細(xì)胞外，從而減少細(xì)胞內(nèi)的有效藥物濃度，以達(dá)到腫瘤耐藥的目的。

2 HIF

HIF在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它是缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，也是調(diào)節(jié)腫瘤新生血管生成、能量代謝、細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白[3-4]。HIF是由α亞基和β亞基組成的異二聚體，主要包括HIF-1α、HIF-2α和HIF-β。

2.1 HIF-1α、HIF-2α和HIF-β的結(jié)構(gòu) HIF-α最早是在Hep3B細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的，當(dāng)時(shí)是作為一種能被低氧誘導(dǎo)的具有EPO基因增強(qiáng)子結(jié)合活性的核蛋白因子被研究的[5]。以后又觀察到該因子對(duì)多種低氧反應(yīng)基因(HRG)的轉(zhuǎn)錄都有調(diào)控作用,并可能參與對(duì)低氧反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，遂命名為HIF-1α。隨后，HIF-2α也被發(fā)現(xiàn)和克隆[6]。HIF-2α是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的HIF-1α的蛋白同系物，與HIF-lα 48%的氨基酸序列相同[7]。β亞基又名芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白(arylhydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)。α亞基和β亞基都含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)和PAS(PER-ARNT-SIM)結(jié)構(gòu)，bHLH區(qū)是形成HIF二聚體必需的結(jié)構(gòu)，PAs區(qū)為DNA結(jié)合所必需。HIF-1α由826個(gè)氨基酸組成，分子量約為120kD(HIF- 2α 115kD，HIF-β 94kD)。該蛋白N-端(aa.17～299，HIF-2α為14～301)含有基本的螺旋-套-螺旋結(jié)構(gòu)域(basic-helix-loop-he lix domain，bHLH ) (aa.17～70，HIF-2α為14～67) 和一個(gè)PAS(Per-ARNT/Abr-Sim)結(jié)構(gòu)域，后者包括PAS-A (aa .106～156，HIF-2α為104～157)和PAS-B(aa .249～299，HIF- 2α為250～301)2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。除此之外，α亞基包含有氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域(oxygen dependent domain，ODD)，對(duì)缺氧刺激產(chǎn)生反應(yīng)[8]。

2.2 HIF-1α與HIF-2α的功能 研究認(rèn)為，HIF的功能主要是由α亞基決定的。HIF-1α和HIF-2α雖然在結(jié)構(gòu)上非常相似，但其表達(dá)及功能卻有很大的差異[9]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，缺乏HIF-2α的小鼠胚胎肺發(fā)育延遲，出生不久死亡是由于肺泡上皮細(xì)胞VEGF下降，肺泡表面活性物質(zhì)減少而死于呼吸窘迫[10]。可見(jiàn)，HIF-2α在功能上有別于HIF-1α，其作用過(guò)程似乎主要在器官和胚胎發(fā)育階段。研究表明，識(shí)別并結(jié)合共同的DNA區(qū)域并不足以調(diào)節(jié)下游基因，氨基末端的相同是兩者能調(diào)節(jié)共同基因的基礎(chǔ)，而兩者羧基端的不同卻導(dǎo)致兩者有不同的靶向基因[11]。另外，HIF-1α和HIF-2α能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子不同，這也導(dǎo)致了兩者能調(diào)節(jié)的基因不同。后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)HIF-1α能增強(qiáng)其下游靶基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、葡萄糖轉(zhuǎn)錄因子1(GLUTl)和糖酵解酶等基因的表達(dá)，促進(jìn)血管的生成和細(xì)胞能量代謝，影響腫瘤的進(jìn)展[12-13]。與HIF-1α相似，HIF-2α同樣具有核轉(zhuǎn)錄活性，兩者具有相似的DNA識(shí)別位點(diǎn)，即VEGF和EPO等上的“低氧反應(yīng)元件”(hypoxia-response element，HRE)[14]。然而，HIF-1α和HIF-2α所調(diào)節(jié)的下游基因卻不盡相同。HIF-1α獨(dú)自調(diào)節(jié)的基因有糖酵解相關(guān)酶類和凋亡相關(guān)基因BNIP-3。而胚胎轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α和促紅細(xì)胞生成素EPO卻是由HIF-2α獨(dú)自調(diào)節(jié)的。有在研究對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞株成功進(jìn)行了缺氧培養(yǎng)，并在多個(gè)缺氧時(shí)點(diǎn)進(jìn)行了HIF-α的檢測(cè)，結(jié)果顯示，HIF-1α對(duì)于急性缺氧環(huán)境極為敏感，其表達(dá)在4h即至高峰，而HIF-2α在慢性缺氧環(huán)境有持續(xù)較強(qiáng)表達(dá)，可見(jiàn)HIF-1α和HIF-2α在缺氧過(guò)程調(diào)節(jié)中可能各有側(cè)重，即HIF-1α是急性缺氧期的主要反應(yīng)因子，而HIF-2α則主導(dǎo)慢性缺氧調(diào)節(jié)[15]。

3 HIF對(duì)腫瘤多藥耐藥的影響

抗癌藥物多數(shù)進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛且血供好的腫瘤細(xì)胞群，很少進(jìn)入缺氧的細(xì)胞，并且慢性缺氧的腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)離于大血管，這樣缺氧的腫瘤細(xì)胞得到的抗癌藥物量就少，所以腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下對(duì)化療藥物是不敏感的，因此缺氧可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生耐藥性的重要原因[16]。

3.1 HIF-1α與腫瘤多藥耐藥的關(guān)系 HIF-1α是目前研究最多的細(xì)胞在低氧環(huán)境下發(fā)揮重要作用的核轉(zhuǎn)錄因子，現(xiàn)針對(duì)HIF的研究多數(shù)集中在HIF-1α上。HIF-1α參與缺氧介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制主要集中在HIF-1α誘導(dǎo)MDR1/P-gp表達(dá)，從而減少化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的蓄積和抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面[17]。由MDR1基因編碼的P-gp與MDR的關(guān)系最為密切。Wartenberg等[18]發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境下P-gp和HIF-1α均上調(diào)，提示HIF-1α與腫瘤抗放、化療機(jī)制有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MDR1是HIF-1α調(diào)控的靶基因。Comerford等[19]通過(guò)對(duì)人體上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧條件下MDR1/P-gp表達(dá)進(jìn)行分析，證明了缺氧會(huì)誘導(dǎo)MDR1/P-gp的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在MDR1啟動(dòng)子-49-45上存在功能性的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)(缺氧反應(yīng)元件)。用反義寡核苷酸阻遏HIF-1α表達(dá)，可明顯阻遏缺氧誘導(dǎo)的MDRI的表達(dá)，甚至完全喪失。研究發(fā)現(xiàn)缺氧處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo中HIF-1α和 P-gp的表達(dá)顯著增加，抑制HIF-1α后，MDR1/P-gp mRNA或蛋白的表達(dá)不論是在LoVo單層細(xì)胞還是MCS中都降低[20]。HIF-1α還會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Erler等[21]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞、肝細(xì)胞瘤、卵巢上皮細(xì)胞、肺和胚胎纖維原細(xì)胞中，缺氧條件下促凋亡分子Bid呈HIF-l依賴性下調(diào)，從而成為細(xì)胞存活的原因。Akakura等[22]的研究結(jié)果也證實(shí)了相似的HIF-1α抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)常氧條件下HIF-1α組成性表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞系比無(wú)HIF-1α表達(dá)的其他細(xì)胞系更能抵抗缺氧和無(wú)糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Carmeliet等[23]用低氧處理野生型的胚胎干細(xì)胞(ES，HIF - 1α+/+) 和HIF-1α基因失活的胚胎干細(xì)胞(ES，HIF-1α-/-)，發(fā)現(xiàn)前者細(xì)胞增殖減少、細(xì)胞凋亡增加，而后者無(wú)明顯變化；接著對(duì)胚胎干細(xì)胞來(lái)源的腫瘤進(jìn)行培養(yǎng)，同樣發(fā)現(xiàn)HIF-1α-/-基因型腫瘤比HIF-1α+/+基因型腫瘤的細(xì)胞凋亡少，證明低氧通過(guò)HIF-1α誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡 。Piret等[24]研究表明HIF-1α潛在抗凋亡作用，它能夠通過(guò)使MCL-1蛋白過(guò)度表達(dá)對(duì)抗細(xì)胞凋亡。HIF-1α能夠下調(diào)促凋亡分子的表達(dá)是其抗細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

3.2 HIF-2α對(duì)腫瘤的影響 HIF-2α是今年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的缺氧誘導(dǎo)因子。目前，雖然它與腫瘤相關(guān)的研究較少，但已引起國(guó)內(nèi)外腫瘤醫(yī)學(xué)界研究者的廣泛重視，相關(guān)研究正在不斷展開(kāi)。

MDR和侵襲轉(zhuǎn)移往往是惡性腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因。研究表明，HIF-2α與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Imamura等[25]2009年報(bào)道了在結(jié)腸癌中，HIF-2α表達(dá)率下降，而HIF-1α表達(dá)率不下降，這與結(jié)腸癌進(jìn)一步發(fā)展有很高的相關(guān)性。Wang等[26]通過(guò)對(duì)102塊乳腺腫瘤病理組織研究，發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著相關(guān)，最重要的是與介導(dǎo)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的間質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)顯著相關(guān)。有研究將HIF-2α基因沉默后，HeLa細(xì)胞的成瘤性和侵襲力明顯下降；HIF-2α基因表達(dá)下調(diào)可使HeLa細(xì)胞的成瘤性比常氧條件下明顯降低而細(xì)胞侵襲力不受氧因素的影響[27]。進(jìn)一步觀察轉(zhuǎn)染HIF-2α-siRNA后的胃癌SGC7901細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞凋亡率明顯上升，淋巴細(xì)胞/白血病-2(bcl-2)表達(dá)顯著下降，bcl-2相關(guān)x蛋白(bax)、半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)-3的表達(dá)顯著上升，表明沉默HIF-2α后，能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，提示HIF-2α具有抑制胃癌細(xì)胞凋亡的作用[28]。

HIF-2α還通過(guò)介導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路來(lái)影響腫瘤的增殖。研究發(fā)現(xiàn)RNAi沉默HIF-2α表達(dá)能夠降低乳腺球數(shù)量和大小，其機(jī)制可能通過(guò)HIF-2α介導(dǎo)的干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路參與對(duì)低氧下乳腺球生成的調(diào)控[29]。近年研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)與腫瘤耐藥性密切相關(guān)，VEGF是刺激腫瘤血管生成最主要的因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，對(duì)MDR1可能有調(diào)節(jié)作用。而沉默掉肝癌細(xì)胞中的HIF-2α后，VEGF表達(dá)下降、肝癌細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。同時(shí)，該研究還證明了肝癌化療藥索拉菲尼會(huì)誘導(dǎo)HIF-2α的表達(dá)從而阻滯TGF-α/EGFR信號(hào)通路的活性，提高耐藥性，最終導(dǎo)致化療的失敗[30]。

4 HIF靶向治療的研究進(jìn)展

目前，絕大多數(shù)對(duì)HIF靶向治療的研究是以HIF-1α為中心的。隨著HIF-1α與MDR相關(guān)研究的日益深入，以HIF-1α為靶點(diǎn)的中、西醫(yī)腫瘤治療方法為克服腫瘤化療多藥耐藥提供了新的思路。

4.1 基因靶向治療 70%的腫瘤中存在HIF-1α過(guò)表達(dá)現(xiàn)象，HIF-1α的表達(dá)與腫瘤血管生成、腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Rapisarda等[31]用拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑阻止HIF-1α的積累從而達(dá)到治療腫瘤的目的。Stoeltzing等[32]通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒Phif-1αDNA轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞阻止HIF-1α的作用，使腫瘤生長(zhǎng)減慢，阻斷HIF-1α表達(dá)成為靶向殺傷缺氧腫瘤細(xì)胞的重要策略。其機(jī)制可能為HIF-1α缺失可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)降低，新生血管形成失敗，從而延緩實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。Shibata等[33]構(gòu)建了受缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控的硝基還原酶的載體，在缺氧條件下能將無(wú)毒性的CBl954轉(zhuǎn)化成毒性形式，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都顯示出了抗腫瘤的療效。其機(jī)制是研制出對(duì)HIF-1α高度反應(yīng)的啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)治療基因在腫瘤中的特異性表達(dá)。利用受缺氧反應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控的前藥物轉(zhuǎn)化酶基因，將無(wú)毒性的前藥轉(zhuǎn)化成對(duì)腫瘤有毒性的藥物。

4.2 西藥制劑 目前進(jìn)行臨床試驗(yàn)的幾種新的化療藥的抗腫瘤作用部分可能來(lái)自于它們對(duì)HIF-1α表達(dá)的抑制[34]。如，rapamycin通過(guò)抑制serine/theonine激酶FRAP使P13K-AKT-FRAP誘導(dǎo)的HIF-1α表達(dá)喪失，從而阻止腫瘤血管的生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。在最近的研究中，Kizaka-Kondoh[35]開(kāi)發(fā)了一種融合蛋白藥物(PTD-ODD548-603-procaspase-3)，它與放射治療結(jié)合可以顯著抑制腫瘤和新生血管的生長(zhǎng)。這表明這種融合蛋白是以輻射或缺氧依賴性增加的HIF-1為靶目標(biāo)，抑制腫瘤中HIF-1依賴因子的表達(dá)，如血管生成素和生長(zhǎng)因子等。

4.3 中藥對(duì)HIF-1的影響 中藥歷史悠久，一直以來(lái)在臨床治療中發(fā)揮著重要的作用。中藥配合放化療已有數(shù)十年，其作用廣泛，毒副作用、不良反應(yīng)少，并取得了較好的治療效果。目前，中藥也逐漸被廣泛嘗試用于逆轉(zhuǎn)MDR的治療當(dāng)中，并且其療效已得到了大量臨床、基礎(chǔ)研究的證實(shí)。

最近的一項(xiàng)研究表明，中藥半枝蓮可以抑制肺癌細(xì)胞中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，以及阻滯AKT信號(hào)通路的磷酸化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成，最終導(dǎo)致腫瘤活性下降。這項(xiàng)研究表明，中藥半枝蓮作為一種抗血管生成劑，有逆轉(zhuǎn)MDR的巨大潛力[36]。另一項(xiàng)研究證明，雷公藤能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV-3的增殖。雖然雷公藤能夠上調(diào)HIF-1αmRNA的表達(dá)，但是其誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白并不具有轉(zhuǎn)錄活性[37]，這證明了雷公藤作為逆轉(zhuǎn)MDR藥物的可靠性。Vishvakarma等[38]通過(guò)對(duì)荷瘤小鼠給藥，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠調(diào)節(jié)溶解在腫瘤細(xì)胞中的氧平衡，從而調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)水平。此外，姜黃素還能夠抑制腫瘤細(xì)胞中HIF-1α mRNA、VEGF抗凋亡Bcl-2蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)黃芩素能夠通過(guò)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)和抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的糖酵解，來(lái)逆轉(zhuǎn)大腸癌的MDR[39]。

5 展 望

HIF和MDR的關(guān)系及其機(jī)制的研究正日益受到國(guó)內(nèi)外腫瘤醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。其中，HIF-2α是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的最重要的缺氧誘導(dǎo)因子，目前相關(guān)研究較少，對(duì)其與MDR的關(guān)系等更深入的研究正在逐步展開(kāi)。在逆轉(zhuǎn)MDR的治療中，中西醫(yī)聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了許多腫瘤的臨床緩解率、生存期及生存質(zhì)量，并且可降低化療藥的用量和不良反應(yīng)，優(yōu)于單純的化療藥治療。同時(shí)，中藥作為逆轉(zhuǎn)MDR的新思路，其機(jī)制有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和證實(shí)?？傊邪l(fā)靶向HIF的中、西醫(yī)新藥來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥具有非常廣闊的前景。

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10.3969/j.issn.1008-8849.2015.14.043

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1008-8849(2015)14-1590-04

2014-10-08